الكشف عن الأجسام المضادة المضادة للجليكان المنتشرة باستخدام مصفوفة الجليكان المطبوعة

الملخص

المصدر: Olivera-Ardid، S. et al. ، مصفوفة الجليكان المطبوعة: تقنية حساسة لتحليل ذخيرة الأجسام المضادة المضادة للكربوهيدرات المنتشرة في الصغيرة.J. Vis. Exp.(2019)

يوضح هذا الفيديو تقنية مصفوفة الجليكان المطبوعة لتحليل الأجسام المضادة المضادة للجليكان المنتشرة في مصل الفأر. تتفاعل الأجسام المضادة في المصل مع جليكانات معينة على الرقاقة ، وهو ما يؤكده التلوين المناعي متبوعا بالمسح الفلوري.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة

1. إنتاج رقائق السكر

1. إعداد المصفوفات الدقيقة
   1. اطبع الجليكان (50 ملم) والسكريات (10 ميكروغرام / مل) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 300 ملي مولار (PBS ، درجة الحموضة 8.5) في 6 مكررات على شرائح زجاجية مشتقة من N-hydroxysuccinimide ، باستخدام مصفوفة روبوتية غير متلامسة (حجم الإسقاط ~ 900 pL). تحتوي كل شريحة على 4 كتل مختلفة من المصفوفات الفرعية (الشكل 1 أ ، بالألوان) تتكرر 6 مرات. تتكون كل مصفوفة فرعية من 112 بقعة جليكان مختلفة ، بما في ذلك عناصر التحكم (8 صفوف × 14 عمودا) (الشكل 1 ب). < / > ملاحظه: يتم توفير المعلومات المتعلقة بالجليكان في الجدول 1. مكتبة الجليكان المستخدمة لطباعة الرقائق الدقيقة هي نتيجة جهد تركيبي طويل الأمد لفريق IBCh. يتم وصف أمثلة التوليف في المنشورات ذات الصلة. تضمنت مكتبة الجليكان مستضدات فصيلة الدم وبعض السكريات قليلة السكاريد الطرفية الأكثر شيوعا ، بالإضافة إلى الزخارف الأساسية للبروتينات السكرية والجليكوليبيدات المرتبطة ب N و O للثدييات ، ومستضدات الكربوهيدرات المرتبطة بالورم ، والسكريات من البكتيريا المسببة للأمراض.
   2. احتضان الشرائح في صندوق رطوبة (الرطوبة النسبية ~ 70٪) في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة.
   3. حجب المصفوفات الدقيقة: احتضان الشرائح لمدة 1.5 ساعة مع مانع عازل في درجة حرارة الغرفة (100 ملي مولار حمض البوريك ، 25 ملي مولار إيثانول أمين ، 0.2٪ (حجم / حجم) توين -20 في ماء عالي النقاء).
   4. اغسل الرقاقة الجليكوبينية بالماء فائق النقاء وجففها بالهواء.
2. مراقبة جودة Glycochip
   1. قم بتحليل مصفوفتين دقيقتين من كل دفعة باستخدام محلول 1 مجم / مل من تحضير الغلوبولين المناعي المعقد (CIP ، الذي يحتوي على الغلوبولين المناعي: IgG و IgM و IgA) ، محلول 10 ميكروغرام / مل من الغلوبولين المناعي المضاد للإنسان من الماعز البيوتينيل كجسم مضاد ثانوي (IgM + IgG + IgA) ، متبوعا بمحلول 1 ميكروغرام / مل من الستربتافيدين المترافق الفلوري المقابل (عبر البروتوكول الموضح أدناه ، انظر الخطوة 2).
   2. مسح وتحليل رقائق الجليكو (انظر الخطوة 3 ، تحليل مصفوفة الجليكان).
   3. استخدم دفعات المصفوفات الدقيقة ذات الارتباط داخل الشريحة وفيما بينها أعلى من 0.9.

< p class = "jove_title" >2. تقنية مصفوفة الجليكان

1. تحضير المحاليل المائية التالية (في ماء عالي النقاء) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية):
   1. العازلة -1: 1٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل الأبقار (BSA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 1٪ (حجم / حجم) توين -20 و 0.01٪ (وزن / حجم) أزيد الصوديوم (NaN₃).
   2. Buffer-2: 1٪ (وزن/حجم) BSA في PBS، و0.1٪ (حجم/حجم) Tween-20 و0.01٪ (وزن/حجم) NaN₃.
   3. Buffer-3: 0.1٪ (حجم حجم / حجم) Tween-20 في PBS.
   4. Buffer-4: 0.001٪ (حجم عدي / حجم) Tween-20 في PBS.
2. جليكوتشيب وتحضير العينة
   1. ضع صندوق التخزين مع الشرائح على الطاولة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).
      ملاحظه: استخدم قفازات اللاتكس الخالية من المسحوق. يجب معالجة رقاقة الجليكوبيس بواسطة الجزء السفلي من الشريحة الزجاجية ، حيث يوجد الرمز الشريطي. سيساعدك الرمز الشريطي على تحديد الجانب الأيمن ، وتجنب ملامسة السطح حيث تتم طباعة الجليكانات.
   2. افتح الصندوق ، وخذ رقاقة الجليكوريب وضعها في غرفة الحضانة (25 درجة مئوية) ، مكيفة بالفعل بورق ترشيح مبلل للحفاظ على الرطوبة ثابتة داخل الغرفة.
   3. وفي الوقت نفسه ، قم بتخفيف مصل الفئران باستخدام Buffer-1 (1:20) في أنابيب سعة 1.5 مل. قم بتجانس محلول المصل (5 ثوان) باستخدام خلاط دوامة. < / > ملاحظه: الحجم اللازم لتغطية سطح رقاقة جليكوتشيب واحد بالكامل هو حوالي 1 مل.
   4. بعد التجانس ، احتضان المصل المخفف عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حمام مائي لتجنب تراكم الغلوبولين المناعي. الطرد المركزي للأنابيب لمدة 3 دقائق عند 10,000 × جم و 25 درجة مئوية ، وجمع المادة الطافية والتخلص من أي مادة مترسبة.
   5. ضع الرقاقة الجليكوتشيب بعناية في غرفة الحضانة. احتضنها لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية مع 1 مل من Buffer-3 للتخلص من أي مادة متبقية على سطح الرقاقة الجليكوبية.
   6. أمسك الرقاقة الجليكوبية في وضع رأسي وأعد غسلها ببعض قطرات Buffer-3 باستخدام ماصة باستور بلاستيكية. قم بإزالة المخزن المؤقت بعناية من سطح رقاقة الجليكوريب باستخدام ورق الترشيح.

< p class = "jove_title" >3. رد الفعل: ربط الأجسام المضادة

1. ضع رقاقة الجليكوريب في غرفة الحضانة. انشر عينة المصل المخففة على سطح رقاقة الجليكوبيه باستخدام ماصة دقيقة. احتضان مع التحريك المداري (30 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. تأكد من تغطية كل المنطقة الجافة من سطح الرقاقة الجليكوبيه بعينة المصل المخففة باستخدام طرف الماصة.
2. قم بإزالة أي عينة زائدة واغمر الرقاقة الجليكوبيس لمدة 5 دقائق في Buffer-3 عند 25 درجة مئوية. بعد ذلك ، انقل رقاقة الجليكوتشيب إلى وعاء به Buffer-4 (5 دقائق) وأخيرا اغسل (5 دقائق) رقاقة الجليكوتشيب بماء فائق النقاء. الطرد المركزي للرقاقة الجليكوبينية لمدة 1 دقيقة عند 175 × جم و 25 درجة مئوية لإزالة السائل.

< p class = "jove_title" >4. الكشف: الجسم المضاد الثانوي

1. ضع رقاقة الجليكوريب في غرفة الحضانة. انتشر على سطح رقاقة الجليكوبيس محلول (5 ميكروغرام / مل) من الماعز المضاد للفأر (IgG + IgM) المقترن بالبيوتين في Buffer-2. احتضان مع التحريك المداري (30 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
2. قم بإزالة الكسر غير المرتبط وكرر خطوات الغسيل.
3. بعد الطرد المركزي ، قم باحتضان رقاقة الجليكوتشيب في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة (30 دورة في الدقيقة) مع 2 ميكروغرام / مل من محلول الستربتافيدين المقابل المسمى بالفلوروكروم (في Buffer-2).
4. في الظلام ، قم بإزالة الجزء غير المرتبط وكرر خطوات الغسيل.
5. جفف الرقاقة الجليكوتشيب عن طريق الهواء.
   ملاحظه: يجب مسح Glycochip في أسرع وقت ممكن. ولكن إذا كان من المستحيل إجراء الفحص مباشرة بعد التلوين ، فيمكن تخزين رقائق السكر في مكان بارد وجاف في الظلام.

< p class = "jove_title" >3. تحليل مصفوفة الجليكان

1. مسح المصفوفة ضوئيا
   1. اترك رقاقة الجليكوشيب على المنضدة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة في الظلام. في الوقت نفسه ، قم بتشغيل الماسح الضوئي للشرائح والليزر (الطول الموجي للإثارة 633 نانومتر).
   2. أمسك المصفوفة الدقيقة ، حرك رقاقة الجليكو في الفتحة حتى تلامس الخلف.
   3. امسح رقاقة الجليكوتشيب ("تشغيل المسح السهل") ، واحفظ الفحص باعتباره ". TIFF" .

الجدول 1: قائمة الجليكانات ، وارتباطها بالأجسام المضادة الطبيعية المنتشرة (IgM + IgG) لفئران BALB / c (ن = 20) ، معبرا عنها بوحدات التألق النسبية (RFU) كمتوسط ± MAD ، وعدد التي تتجاوز المقطوعة (≥4000 RFU). تم استنساخ هذا الجدول من Bello-Gil، D. et al. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التمثيل التخطيطي (ليس على نطاق واسع) لتكوين مصفوفة الجليكان وطباعتها وتحليلها.(أ) تم تطوير الرقائق الدقيقة المطبوعة بمكتبة تضم 419 هيكلا مختلفا من الجليكان ، متبوعا بالكشف باستخدام جسم مضاد ثانوي مناسب يحمل علامة فلورسنت. تحتوي كل شريحة على 4 كتل مختلفة من المصفوفات الفرعية (بالألوان) ، تتكرر 6 مرات. تتكون كل مصفوفة فرعية من 112 بقعة جليكان مختلفة (8 صفوف × 14 عمو...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الاجسام المضاده الماعز البيوتينيل المضاد للإنسان Igs ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية المرجع #: 31782 الماعز البيوتينيل المضاد للفأر IgM + IgG ثيرمو فيشر العلمي المرجع #: 31807 معدات المصفوفة الروبوتية sciFLEXARRAYER S5 Scienion AG ، برلين ، ألمانيا http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ صينية البقع (غرفة حضانة الشريحة) Simport ، Beloeil ، مراقبة الجودة ، كندا المرجع #: M920-2 الطرد المركزي إيبندورف ، هامبورغ ، ألمانيا المرجع #: 5810 R الماصات جيلسون ، ميدلتون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية http://www.gilson.com/en/Pipette/ الماسح الضوئي للشرائح بيركين إلمر ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية برنامج ScanArray GX Plus حاضنة الاهتزاز كول بارمر ، ستافوردشاير ، المملكة المتحدة المرجع #: SI50 العينات البيولوجية BALB / ج مصل الفئران هذه الورقة غير متاح تحضير الغلوبولين المناعي المركب (CIP) Immuno-Gem ، موسكو ، روسيا http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 المواد الكيميائية والكواشف والجليكان مكتبة جليكان معهد الكيمياء العضوية الحيوية (IBCh) ، موسكو ، روسيا غير متاح ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، المرجع #: A9418 الإيثانولامين سيجما ألدريتش المرجع #: 411000 توين 20 شركة ميرك للكيماويات وعلوم الحياة ، مدريد ، إسبانيا المرجع #: 655204 محلول ملحي مخزن بالفوسبات (PBS) VWR International Eurolab SL ، برشلونة ، إسبانيا المرجع #: E404 أزيد الصوديوم سيجما ألدريتش المرجع #: S2002 ستربتافيدين أليكسا فلور 555 مترافق ثيرمو فيشر العلمي المرجع #: S21381 Streptavidin Cy5 مترافق جنرال إلكتريك للرعاية الصحية ، ليتل تشالفونت ، باكينجهامشير ، المملكة المتحدة المرجع #: PA45001 المواد شرائح زجاجية مشتقة من N-hydroxysuccinimide H شوت نكستريون ، جينا ، ألمانيا المرجع #: 1070936 ورق ترشيح Whatman سيجما ألدريتش المرجع #: WHA10347509 أنابيب 1.5 مل إيبندورف المرجع #: 0030120086 البرامج والخوارزميات نظام تحليل المصفوفات الدقيقة ScanArray Express بيركين إلمر http://www.per
kinelmer.com/microarray