تقنية المصفوفة الدقيقة للببتيد لتنميط خصوصية الأجسام المضادة

1. تحت عنوان "تخطيط تخطيط شريحة" على واجهة ArrayNinja ، انقر فوق الرابط الذي يتوافق مع طابعة المصفوفة الدقيقة المستخدمة.
   ملاحظه: تمت برمجة ArrayNinja لتقليد الحركة الروبوتية لطابعتين شائعة الاستخدام من المصفوفات الدقيقة (انظر الجدول 1). يمكن تكوين التوافق مع المصفوفات الأخرى عند الطلب.
2. انقر داخل مربع الحوار "تحميل اللوحة" ، واكتب "فارغ" ، وانقر فوق "إدخال". انظر الشكل 1 للحصول على لقطة شاشة لوحدة تصميم ArrayNinja.
3. اضبط قطر البقعة على 275 ميكرومتر والتباعد الموضعي إلى 375 ميكرومتر. اضبط الإعدادات المتبقية (كتل اللوحة/صف اللوحة، إجمالي صفوف اللوحة، التكرارات، الميزات في y، Super Arrays، SuperA fudge؛ انظر الشكل 1) لتخصيص كيفية ظهور الميزات على شريحة المصفوفة الدقيقة.
   ملاحظه: يتم تحديد قطر البقعة حسب حجم دبوس المصفوفة الدقيقة. أثناء ضبط هذه الإعدادات ، سيتم تحديث شريحة الرسوم المتحركة في الوقت الفعلي. استخدم هذا الرسم الكارتوني لمعاينة كيفية قيام كل إعداد بتعديل تخطيط الشريحة النهائية.
4. بعد الانتهاء من تخطيط الميزات على الشريحة، قم بتمرير الماوس فوق كل ميزة فريدة وأدخل معرف الميزة في مربع الحوار المنبثق.
   ملاحظه: يمكن أن تتكون معرفات الميزات من أرقام أو أحرف أو مجموعات. هذا مطلوب فقط للميزات الفريدة، ولن يظهر مربع حوار عند تحديد النسخ المتماثلة.
5. بعد تعيين معرف لجميع الميزات الفريدة ، انقر فوق "تعبئة". أدخل اسما لتخطيط الشريحة وانقر فوق "طباعة اللوحة الخاصة بك" للحفظ. سيتم فتح صفحة جديدة تعرض عدد لوحات المصدر 384 البئر اللازمة لتصنيع تصميم الشريحة المختارة وجدول يرسم خريطة للموقع الفعلي لكل ميزة ليتم تحميلها في لوحة (لوحات) المصدر.
   ملاحظه: تذكر هذا الاسم ، حيث سيتم استخدامه لتذكر هذا التصميم عند تحليل بيانات المصفوفات الدقيقة. يؤدي النقر فوق "طباعة اللوحة الخاصة بك" إلى حفظ التخطيط داخل ArrayNinja.

1. تحضير لوحة المصدر
   1. استخدم الخريطة التي تم إنشاؤها باستخدام ArrayNinja لإنشاء لوحة (لوحات) المصدر المكونة من 384 بئر.
      ملاحظة: يمكن العثور على أوصاف مفصلة للببتيدات التي تم الاستعلام عنها على هذه المنصة في مكان آخر.
   2. قم بإيداع 1 - 2 ميكرولتر من كل ميزة (على سبيل المثال ، ببتيد هيستون البيوتينيل) في البئر الصحيح للوحة (صفائح) المصدر المكونة من 384 بئر.
      ملاحظه: عادة ما يتم ترسيب ببتيدات الهيستون البيوتينيل من 200 - 400 ميكرومتر من محاليل المخزون ، وهو ما يعادل 10 إلى 25 ضعفا من المولار الزائد من الببتيد إلى مواقع ربط الستربتافيدين في بقعة مصفوفة واحدة. يتم حساب ذلك باستخدام المعادلة:
      
      حيث V هو الحجم الذي يتم تسليمه بواسطة دبوس ، [P] هو تركيز الميزة التي تتم طباعتها ، و NA هو رقم Avogadro ، و S هي مساحة سطح البقعة. C هي تغطية الشريحة ، معبرا عنها بعدد جزيئات الستربتافيدين لكل وحدة مساحة مضروبا في ثلاثة (متوسط عدد مواقع ربط الستربتافيدين المتاحة). يتم الحصول على V و C من قبل الشركة المصنعة المعنية. قد تتطلب الميزات الأخرى تركيزات مختلفة اعتمادا على حجم الجزيء الحيوي حيث قد يكون الازدحام مصدر قلق. يجب اختبار مجموعة من تركيزات الطباعة لكل نوع جديد من الميزات تجريبيا لتحديد تركيز الطباعة الأمثل.
   قم
   3. بتخفيف كل ميزة 10 أضعاف مع مخزن مؤقت للطباعة 1x مكمل بألبومين مصل بقري بنسبة 1٪ (BSA). قم بتدوير لوحة (لوحات) المصدر عند 500 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظه: يوصى بإدراج البيوتين المسمى بالفلورسين (5 ميكروغرام / ميكرولتر) في مخزن الطباعة كعنصر تحكم في الاكتشاف وكمساعد بصري لتسهيل محاذاة المصفوفة المناسبة أثناء التحليل (انظر الشكل 3).
2. بروتوكول الطباعة (الشكل 2 أ - ب).
   1. قم بإعداد المصفوفة عن طريق إفراغ حاوية جمع النفايات وملء حاوية محلول الغسيل وحاوية المرطب بالماء المقطر المعقم.
   2. أدخل المعلمات المستخدمة لتصميم الشريحة في ArrayNinja (الشكل 1) في برنامج التحكم في طابعة المصفوفات الدقيقة.
   3. باستخدام برنامج التحكم في طابعة المصفوفات الدقيقة ، اضبط إجراء الغسيل لغسيل 1 ثانية مع غمر واحد. اضبط إعدادات ما بعد الغسيل لإعادة غمس المسامير 5 مرات بعد كل غسلة. اضبط الرطوبة على 60٪.
      ملاحظه: قد يختلف تكوين الغسيل الأمثل وفقا لطابعة المصفوفة الدقيقة المستخدمة. قد يختلف التكوين الأمثل لغمس المسمار بعد الغسيل وفقا لطابعة المصفوفات الدقيقة المستخدمة.
   4. أدخل الشرائح الوظيفية (على سبيل المثال ، الزجاج المطلي بالستربتافيدين) في أسطوانات الركيزة وضع جميع الأسطوانات في مصعد الصوانى السطحي. أدخل لوحة (لوحات) المصدر في حامل (حاملات) اللوحة وضعها في مصعد لوحة المصدر.
   5. انقر فوق "طباعة". راقب عملية الطباعة لبضع جولات من ترسيب الميزات للتأكد من صحة جميع إعدادات الغسيل والغمس. عند اكتمال تشغيل الطباعة ، قم بإزالة أسطوانات الركيزة من المصفوفة.
      ملاحظه: عندما تمنع عمليات الطباعة الكبيرة إكمال خطوات الحظر في غضون يوم واحد ، يمكن احتضان الشرائح المطبوعة في غرفة رطبة عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. احتضان الشرائح بجوار كوب صغير من الماء داخل صندوق من الورق المقوى مغلق بغلاف بلاستيكي.
   6. قم بسد الشرائح باستخدام المخزن المؤقت للحجب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الخلط.
   7. اغسل الشرائح 2 × 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.6 مع الخلط. جفف الشرائح عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي منزلق microarray لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظه: لمعالجة عدد كبير من الشرائح في وقت واحد ، يمكن استخدام غرفة غسيل منزلقة مجهر عالية الإنتاجية ، مما يسمح بغسل 50 شريحة بالتوازي.
   8. بالنسبة للشرائح المصممة ليتم تقسيمها بالشمع ، انتقل إلى القسم 2.1. بالنسبة لجميع التصميمات الأخرى ، قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء والرطوبة.
      ملاحظه: تكون ببتيدات الهيستون المطبوعة مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل عند تخزينها بهذه الطريقة.

2. تقسيم شرائح المصفوفات الدقيقة

1. قلم الشمع الكارهة للماء (الشكل 2 ج)
   1. ضع الشمع حول المناطق التي تحتوي على ميزات باستخدام قلم شمع. اترك الشمع يجف في الهواء لمدة 5 دقائق قبل الانتقال إلى القسم 3.
      ملاحظه: بعد الحظر ، قد يكون من الصعب جدا تصور بقع المصفوفة بالعين. يمكن طباعة تصميم الشرائح من ArrayNinja على نطاق واسع واستخدامها كدليل لتطبيق الشمع.
2. حشية السيليكون (الشكل 2 د)
   1. انزع الفيلم الشفاف من الجزء الخلفي من حشية المصفوفة وضع الجانب اللاصق لأسفل على شريحة المصفوفة الدقيقة.
   2. أمسك الحشية في مكانها لمدة 5 ثوان قبل الانتقال إلى القسم 3.
3. بصمة الشمع (الشكل 2E)
   1. بالنسبة للشرائح المصممة ليتم تقسيمها بواسطة الشمع ، اطبع شريحة اختبار على زجاج عادي باستخدام 10٪ BSA. استخدم شريحة الاختبار هذه لتحسين أدلة طابعة الشمع أو إعدادات المصفوفة للتأكد من أن جميع الميزات ستكون داخل غرف قالب الشمع.
   2. قم بتسخين طابعة الشمع microarray إلى 85 درجة مئوية حتى يذوب كل الشمع تماما ، حوالي 30 دقيقة.
   3. أدخل الشريحة بحيث يكون الجانب المطبوع متجها لأسفل وادفع الشريحة بالكامل إلى الدليل الأيمن على طابعة المصفوفة الدقيقة. اسحب الرافعة لأعلى لملامسة القالب لسطح الشريحة. امسك لمدة 2 ثانية < / > ملاحظه: يمكن تغيير وقت الانتظار لتحقيق سمك حدود الشمع الأمثل.
   4. قم بإزالة الشريحة بسرعة وفحص حدود الشمع بصريا للتأكد من أن جميع الآبار مغلقة وأن الحدود ليست سميكة لدرجة أنها تتعدى على البقع. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية محمية من الرطوبة والضوء.
      ملاحظه: يمكن زيادة وقت الانتظار أو تقليله للحصول على حدود أكثر سمكا أو أرق.

3. تهجين جسم مضاد هيستون PTM باستخدام مصفوفة دقيقة من الببتيد

1. تحضير المخزن المؤقت للتهجين (PBS ، درجة الحموضة 7.6 ، 5٪ BSA ، 0.1٪ Tween-20).
2. موازنة الشريحة في المخزن المؤقت للتهجين باستخدام وعاء تهجين. قم بتغطية الشريحة بالكامل في مخزن مؤقت للتهجين واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية على شاكر مداري بسرعة منخفضة.
3. تحضير محلول يحتوي على جسم مضاد هيستون PTM المخفف في مخزن التهجين.
   ملاحظه: في بيانات المثال ، تم تخفيف كل من الجسم المضاد هيستون # 1 والجسم المضاد # 2 1: 1,000 في المخزن المؤقت للتهجين. يوصى بنطاق تخفيف مشابه لتلك المستخدمة في النشاف المناعي كنقطة انطلاق.
4. احتضان المصفوفة بمحلول الجسم المضاد لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة محلول الجسم المضاد وغسل المصفوفة 3 مرات لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام PBS البارد ، درجة الحموضة 7.6.
5. قم بإعداد تخفيف 1: 5,000 - 1: 10,000 من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالصبغة الفلورية في مخزن مؤقت للتهجين.
6. احتضان المصفوفة بمحلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية واغسل شريحة المصفوفة الدقيقة 3 مرات لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام PBS ، درجة الحموضة 7.6. اغمس المصفوفة الدقيقة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 0.1x PBS ، درجة الحموضة 7.6 لإزالة الملح الزائد في درجة حرارة الغرفة. جفف الشريحة في جهاز طرد مركزي منزلق ميكرو في درجة حرارة الغرفة.
7. امسح الشريحة ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي للمصفوفة الدقيقة بدقة 25 ميكرومتر أو أعلى، باتباع بروتوكول المسح الضوئي الموصى به من قبل الشركة المصنعة للماسح الضوئي للمصفوفات الدقيقة.
   ملاحظه: في حالة وجود متتبع البيوتين المسمى بالفلورسين ، فقم بمسح كل من القناة الخضراء (على سبيل المثال: 488 نانومتر ، em: 509 نانومتر) والقناة التي تتوافق مع الجسم المضاد الثانوي المترافق بالصبغة الفلورية ، وعادة ما يكون أحمر (على سبيل المثال: 635 نانومتر ، EM: 677 نانومتر). الهدف من المسح هو الحصول على ملفات .tif قناة واحدة يمكن دمجها في ملف .png واحد.

الشكل 1: وحدة تصميم ArrayNinja. يتم عرض لقطة شاشة لوحدة تصميم ArrayNinja في الخط المنقط. تعرض لوحة التحكم (أعلى) جميع المعلمات التي يمكن تغييرها على طابعة المصفوفة الدقيقة. أثناء ضبط هذه المعلمات ، يتم تحديث الصورة الكرتونية لتخطيط الشريحة (أسفل اليسار) في الوقت الفعلي. بعد تعيين التخطيط، يمكن للمستخدم تمرير الماوس فوق النقاط الفردية لإدخال معرفات الميزات الفريدة. يقوم ArrayNinja من إدخال المستخدم هذا بإنشاء خريطة لموضع كل ميزة في لوحة (لوحات) المصدر (أسفل اليمين) اللازمة لتصنيع تخطيط شريحة مصفوفة دقيقة محدد.

الشكل 2: تصنيع المصفوفات الدقيقة. (أ) تصنيع المصفوفات الدقيقة لببتيد هيستون على شرائح المجهر المطلية بالستربتافيدين باستخدام طابعة المصفوفات الدقيقة التلامسية. (ب) المصفوفات الدقيقة المصنعة من 3 مصفوفات فرعية لشبكة 48 × 48 من ميزات الببتيد. فصل (C) 3 مصفوفات فرعية بقلم شمعي كاره للماء ، (D) 2 subrayrays مع مادة لاصقة من السيليكون ، و (E) 48 مجموعة فرعية ببصمة شمعية. يتم تصنيع جميع المصفوفات الدقيقة المعروضة باستخدام شرائح مجهر مقاس 25 × 75 مم.

الشكل 3: وحدة تحليل ArrayNinja. يتم عرض لقطة شاشة لوحدة تحليل ArrayNinja. تعرض لوحة التحكم (أعلى اليسار) جميع المعلمات التي يمكن ضبطها لتصور المصفوفة والعثور على النقاط ومحاذاة شبكة فوق صورة المصفوفة. يؤدي تمرير الماوس فوق ميزة إلى إظهار طريقة عرض مكبرة (أعلى اليمين) ويعرض نافذة منبثقة تحتوي على معلومات التعريف المقترنة بهذه الميزة (أسفل). النقاط المرجعية المحددة لتصحيح الخلفية برتقالية. الميزات التي سيتم استبعادها من التحليل النهائي بيضاء. يحتوي ArrayNinja على ميزة بحث نصية تسلط الضوء على ميزات المطابقة باللون الأصفر، كما هو موضح في مثال H4K16.