< p class = "jove_title" >
1. تحضير أجنة الزرد
- قم بإعداد أحواض عبور للأسماك في فترة ما بعد الظهر قبل الساعة 5:00 مساء ، مع أنثى سمكة واحدة من النوع البري وذكر واحد من الأسماك Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] باستخدام فواصل لفصلها في كل خزان.
- قم بإزالة الفواصل قبل الساعة 11:00 صباحا من جميع خزانات العبور في صباح اليوم التالي. حافظ على الصمت ولا تزعج الأسماك أثناء تزاوجها. يحدث التفريخ عادة في غضون 30 دقيقة بعد إزالة الفواصل يبقى البيض المخصب في قاع الخزان.
- اجمع البيض المخصب من الخزانات باستخدام مرشح شبكي. انقل البيض عن طريق غسلها في طبق بتري مليء بماء البيض وافحص الأجنة تحت مجهر تشريح بتكبير 10x إلى 20x.
- انقل الأجنة المخصبة إلى بتريدش نظيف يحتوي على ما يقرب من 20 مل من وسط الجنين (100 مل من محلول مخزون 1,000 × يحتوي على 29.4 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 1.27 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، و 4.85 جم من كلوريد الكالسيوم ، وثنائي الهيدرات (CaCl2.2H 2O) ، و 8.13 جم من كبريتات المغنيسيوم سباعية (MgSO4.7H 2O)) مع ماصات باستور زجاجية كبيرة التجويف. احتفظ بالأجنة عند 28 درجة مئوية ، احتفظ ب 50 جنينا مخصبا لكل طبق بتري مع 30 مل من وسط الجنين عند 28.5 درجة مئوية.
ملاحظة: ينتج زوج واحد من الأسماك عادة 100-300 جنين ، ومعدل الإخصاب والبقاء على قيد الحياة للأجنة السليمة يزيد عن 95٪ لكل تزاوج.
- في صباح اليوم التالي ، أخرج الأجنة من الحاضنة في الساعة 8:00 صباحا ، عندما تصل الأجنة إلى مرحلة النمو ~ 18-20 ساعة بعد الإخصاب (HPF). راقبها تحت مجهر التألق عند تكبير 20 ضعفا ، باستخدام الضوء الأبيض في البداية. في ذلك الوقت ، كانت أجنة الزرد في مرحلة 20 جسدية.
- تخلص من الأجنة الميتة الغائمة أو الممزقة تحت المجهر باستخدام ماصة زجاجية.
- قم بتشغيل مصباح الفلورسنت واختر إعداد مرشح البروتين الفلوري الأحمر (RFP) في المجهر. ثم حدد الأجنة ذات التألق الأحمر القوي وانقلها إلى طبق جديد بماء البيض.
- قم بإزالة الأجنة يدويا باستخدام ملقطين دقيقين (يجب أن تكون أطراف الملقط حادة وغير تالفة) تحت الضوء الأبيض (جدول المواد).
- امسك المشيمة بزوج واحد من الملقط وقم بتمزيق المشيمة بالملقط الآخر. افتح المسيل للدموع بعناية باستخدام الملقط ، واجعله كبيرا بما يكفي ليمر الجنين عن طريق دفع الجنين برفق بأطراف الملقط الآخر.
- انقل الأجنة منزوعة الغضب إلى طبق بتري جديد بوسط جنيني طازج لشطفه السريع قبل الحقن المجهري.
فئة < ص = "jove_title" >
2. تحضير الحقن المجهري
- استخدم الشعيرات الدموية (القطر الخارجي 1.2 مم (OD) ، القطر الداخلي 0.9 مم (ID) ، مع خيوط) لسحب إبر الحقن الدقيقة على مجتذب. تصميم وتحسين برنامج السحب وفقا للكتيب.
- افتح طرف الإبرة بالملقط تحت مجهر تشريح مجسم. اجعل قطر الطرف حوالي 10 ميكرومتر وزاوية الاستدقاق حوالي 30 درجة.
- اقتران الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل Dld مع المضاد للماوس-IgG-Atto647N قبل الحقن.
- لكل تجربة حقن ، امزج 0.5 ميكرولتر من الجسم المضاد ل Dld (0.5 مجم / مل) مع 2 ميكرولتر من الجسم المضاد للفأر IgG-Atto647N (1 مجم / مل) عن طريق سحب العينات 5-10 مرات. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل (أو على الثلج لمدة 2-3 ساعات).
- بعد الحضانة ، أضف 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (10 مجم / مل IgG للفأر) و 0.5 ميكرولتر من 0.5٪ فينول أحمر إلى خليط الأجسام المضادة والماصة 10x لخلطها جيدا لمنع أي أجسام مضادة غير مترافقة متبقية في ><الخليط.
ملاحظه: لكل تجربة ، قم بإعداد خليط إضافي واحد بدون الجسم المضاد ل Dld واستخدمه كعنصر تحكم.
- تحضير 1٪ من الاغاروز منخفض نقطة الانصهار في وسط الجنين. سخني الخليط المحتوي على الاغاروز على حرارة 70 درجة مئوية حتى يصبح الخليط شفافا.
- Aliquot محلول الاغاروز في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل. احتفظ بالحصص في كتلة حرارية عند ~ 40 درجة مئوية.
- اشطف الجنين في الأنبوب الذي يحتوي على 1٪ من الاغاروز منخفض نقطة الانصهار لمدة 3 ثوان.
- ضع الجنين على غطاء طبق بتري بلاستيكي مقلوب مع قطرات فردية من الاغاروز (~ 30-40 ميكرولتر) لتركيب كل جنين على حدة على الغطاء كما هو موضح في الشكل 1. ضع الأجنة بشكل مسطح بشكل جانبي في الاغاروز واحتفظ بهذا الوضع حتى يتجمد الاغاروز في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتركيب 12 جنينا في ثلاثة صفوف واحدا تلو الآخر على النحو الوارد أعلاه. قم بتغطية جميع الأجنة المثبتة في الاغاروز بوسط البيض.
< ص الفئة = "jove_title" >
3. الحقن المجهري
- ضع الأجنة المضمنة تحت المجهر المجسم وقم بتغطية الاغاروز بماء البيض.
- اضبط حاقن ضغط الهواء مع المعالجات الدقيقة ، ووضعها بالقرب من المجاهر كما هو موضح في الشكل 1. استخدم أسطوانة الغاز الفولاذية التي تحتوي على النيتروجين الغازي (N2) تحت ضغط عال كمورد للهواء.
- افتح صمام الغاز فقط بعد تركيب الأجنة في الاغاروز. بعد ذلك ، قم بتحميل الإبرة الزجاجية المحضرة بمقدار 2 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة على المعالج الدقيق ، كما هو موضح في الشكل 1 ، عند استخدام وحدة التعبئة الأمامية للحاقن الدقيق.
- اضبط ضغط الإدخال إلى ~ 80-90 رطل لكل بوصة مربعة ، وضغط الحقن إلى ~ 20 رطل لكل بوصة مربعة.
- معايرة حجم الحقن باستخدام ميكرومتر تحت المجهر ، كما هو موضح سابقا. اضبط المدة الزمنية للضبط لتكون من 10 مللي ثانية إلى 120 مللي ثانية ، وفقا لحجم فتحة الإبرة. قم بتوصيل كل نبضة حقن عن طريق النقر على المضرب. اضبط حجم الحقن لكل تسليم إلى ~ 4-5 nL.
- كزة طرف إبرة الحقن المجهري من خلال لوحة السقف الظهرية للدماغ الخلفي الخلفي إلى نقطة المفصلة r0 / r1 ، وحقن حوالي 10 نانولتر (نبضتان أو ثلاث نبضات) من خليط الأجسام المضادة دون ضرب أنسجة المخ. لاحظ تدفق السوائل الحمراء في بطين الدماغ.
ملاحظه: البطين الخلفي للدماغ الخلفي هو الخلفي لحدود الدماغ الخلفي في الدماغ الأوسط. يملأ خليط الأجسام المضادة المحتوية على الفينول الأحمر المحقون بطين الدماغ من الدماغ الخلفي إلى الدماغ الأمامي على الفور عن طريق الانتشار بالسائل النخاعي.
- بعد الحقن ، قم بإزالة طرف الإبرة من الجنين بسرعة عن طريق تدوير مقبض المعالج الدقيق. للحصول على حقن ناجح ، تبقى الصبغة الحمراء للخليط المحقون في بطين الدماغ بثبات دون أن تتسرب إلى الاغاروز المحيط.
- حرك لوحة التثبيت أسفل المجهر لتحديد موقع جنين آخر مركب في وضع مناسب للتكرار.
- بعد حقن ستة إلى ثمانية أجنة ، قشر الاغاروز بسكين جراحي مجهري لتحرير الأجنة من الاغاروز المضمن. انقل الأجنة المحقونة إلى طبق طازج يحتوي على 30 مل من وسط الجنين ، وضعها في درجة حرارة الغرفة للخطوات التالية.
4. تركيب والتصوير المباشر بفاصل زمني
- بعد 30 دقيقة ، انقل الأجنة المختارة إلى 10 مل من وسط الجنين. أضف 420 ميكرولتر من مخزون التريكيين (4 مجم / مل) إلى 10 مل من وسط الجنين لتخدير الأجنة.
- لتركيب الأجنة ، قم بإعداد 0.8٪ من الاغاروز نقطة انصهار منخفضة تحتوي على نفس تركيز التريكيين في الأنبوب. احتفظ بالحصص في كتلة حرارية عند ~ 40 درجة مئوية.
- استخدم ماصة زجاجية لغمر الأجنة المحقونة في الاغاروز الدافئ لمدة 3 ثوان. بعد ذلك ، قم بإزالة الأجنة على الفور من الاغاروز بنفس الماصة الزجاجية وضع الأجنة في وسط أطباق الثقافة ذات القاع الزجاجي مقاس 35 مم مع قطرة من الاغاروز من الأنبوب. ضع جنينا واحدا فقط لكل قطرة على الزجاج.
- قم بتوجيه الأجنة برفق باستخدام مسبار ألياف أو طرف تحميل للحفاظ على الجانب الظهري من الدماغ الجنيني قريبا من القاع الزجاجي قدر الإمكان. اضبط وضع الجنين برفق لتمديد الجنين دون تجعد حيث يتجمد الاغاروز تدريجيا.
- بعد ذلك ، تحقق من وضع الجنين عن طريق قلب الطبق السفلي الزجاجي. تأكد من أن الدماغ الأمامي الظهري بالكامل مع الأجنة المثبتة بشكل صحيح يمكن رؤيته تحت المجهر.
- أضف 2-3 مل من 28.5 درجة مئوية وسط جنيني مسخن مسبقا يحتوي على التريكيين لتغطية الجنين. ضع الطبق بشكل صحيح في مرحلة التحكم في درجة الحرارة في المجهر متحد البؤر ، كما هو موضح في الشكل 1. اضبط درجة حرارة غرفة التصوير لتكون عند 28.5 درجة مئوية. الجنين جاهز الآن للتصوير.
