توطين مناعي لبروتينات أرابينوجالاكتان والبكتين في الأنسجة النباتية

الملخص

المصدر: كوستا، م.، وآخرون. التوطين المناعي الفلوري لبروتينات أرابينوجالاكتان والبكتين في جدار الخلية للأنسجة النباتية. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تقنية تلطيخ مناعي لتوطين بروتينات أرابينوجالاكتان (AGPs) والبكتين في الأنسجة النباتية. يتم تلطيخ أقسام الأنسجة النباتية الثابتة والمضمنة بالراتنج بالأجسام المضادة الأولية والفلورية الخاصة ب AGP والبكتين وصبغة فلورية مرتبطة بالسليلوز للكشف عن توضعها الخاص بالأنسجة في جدار الخلية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحديد موقع المناعة

ملاحظة: يعتمد إجراء تحديد الموقع المناعي الفلوري على الاستخدام المتسلسل لجسمين مضادين. يتم رفع الجسم المضاد الأساسي ضد مستضد مستهدف محدد. يتم رفع الجسم المضاد الثانوي على وجه التحديد ضد الجسم المضاد الأولي وبالنسبة لتقنيات الفلورسنت يتم ترافقه مع الفلوروفور (FITC [فلورسين إيزوثيوسيانات] في هذا البروتوكول المحدد). سيتم استخدام الجسم المضاد الأساسي للكشف عن المستضد المستهدف في العينة ، وسيتم استخدام الجسم المضاد الثانوي لتحديد الموقع الذي يتصل فيه الجسم المضاد الأولي بالعينة بعد غسل فائض الجسم المضاد الأولي. تعد الضوابط جزءا مهما من هذا الاختبار ويجب إجراؤها دائما لضمان دقة الملاحظات. يجب حجز بئر واحد على الشريحة للاستخدام كعنصر تحكم سلبي ، حيث سيتم تخطي علاج الأجسام المضادة الأولية ، وبالتالي لا ينبغي ملاحظة أي إشارة في نهاية التجربة. يجب تضمين عنصر تحكم إيجابي في التجربة عن طريق معالجة بئر بجسم مضاد معروف ومؤكد بالفعل. يتم استخدام التحكم الإيجابي لتأكيد فعالية وضع العلامات على الأجسام المضادة الثانوية وظروف رد الفعل بينما يختبر التحكم السلبي خصوصية الجسم المضاد الثانوي.

1. قم بإعداد غرفة حضانة عن طريق وضع بعض المناشف الورقية المبللة في الجزء السفلي من صندوق أطراف الماصة ولفها بورق قصدير (الشكل 1B-1E). ضع الشرائح في غرفة الحضانة.
2. ماصة قطرة 50 ميكرولتر لكل بئر 8 مم من محلول المانع (5٪ حليب جاف خالي الدسم (وزن / حجم) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات بمقدار 1 متر [PBS]) واحتضانها لمدة 10 دقائق. قم بإزالة محلول الانسداد وغسل جميع الآبار مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق.
3. تحضير محاليل الأجسام المضادة الأولية (انظر الجدول 1) ، 1: 5 (v / v) الجسم المضاد في محلول الحجب ؛ قم بتقدير حوالي 40 ميكرولتر لكل 8 مم بئر.
   ملاحظه: يجب تعديل تركيز الجسم المضاد وفقا لبروتوكول المصنع.
4. قم بإجراء غسيل نهائي بالماء المقطر المزدوج (ddH₂O) لمدة 5 دقائق ، ولا تدع الآبار تجف تماما.
5. الماصة محلول الجسم المضاد الأساسي لآبار التفاعل. حل حجب الماصات لآبار التحكم.
6. أغلق غرفة الحضانة واتركها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة متبوعة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثانوية ، 1٪ في محلول الحجب (v / v) حوالي 40 ميكرولتر لكل بئر. احتفظ بها مغطاة بورق القصدير.
7. اغسل جميع الآبار مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق ، متبوعة ب 10 دقائق إضافية باستخدام ddH₂O. تأكد من عدم وجود أي أثر لمحلول الانسداد أو الرواسب على الآبار.
8. الماصة محلول الأجسام المضادة الثانوية لجميع الآبار. من الآن فصاعدا ، قم بحماية الشرائح من الضوء.
9. احتضن لمدة 3-4 ساعات في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
10. اغسل جميع الآبار مرتين لمدة 10 دقائق باستخدام PBS متبوعا بغسل آخر لمدة 10 دقائق باستخدام ddH₂O.
11. ضع قطرة من الكالكوفلور (1: 10،000 (وزن / حجم) الفلورسنت أكثر إشراقا 28 في PBS) على كل بئر. بدون غسيل ، ضع قطرة من وسط التثبيت (انظر جدول المواد) على كل بئر وضع غطاء (الشكل 2H).
12. راقب باستخدام مجهر مضان ، مزود بعدسة 10x / 0.45 و 20x / 0.75 و 40x / 0.95 و 100x / 1.40 ، استخدم الأشعة فوق البنفسجية (لصبغة الكالكوفلور) ومرشحات FITC ، للكشف عن جدار الخلية والتوطير المناعي على التوالي (الشكل 2I). استخدم الأطوال الموجية التالية: الإثارة / الانبعاث (نانومتر) 358/461 للأشعة فوق البنفسجية و 485/530 ل FITC.
13. للحصول على تصور أفضل للنتائج ، تداخل كلتا الصورتين مع ImageJ أو ما شابه.

الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المفيدة. يمثل الجدول أعلاه مثالا على الأجسام المضادة المتاحة ، مع معلومات حول أهدافها وأين يمكن شراؤها.

اسم تقارب متاح في LM2 بروتين أرابينوجالاكتان مجسات النبات (ليدز ، المملكة المتحدة) LM5 البكتين LM6 أرابينان LM7 هوموجالاكتورونان LM8 زيلوغالاكتورونان LM13 (1-5) - أ ل- أرابينان لوم 14 بروتين أرابينوجالاكتان LM16 أرابينان المعالجة - RG-I LM18 هوموجالاكتورونان LM19 هوموجالاكتورونان ال م 20 هوموجالاكتورونان إل إم 26 متفرعة - جالاكتان LM30 بروتين أرابينوجالاكتان جيم 5 منخفض الأسترة الميثيل homogalacturonan CCRC (جورجيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) جيم 7 هوموجالاكتورونان عالي الأستيرة جيم 4 بروتين أرابينوجالاكتان جيم 8 بروتين أرابينوجالاكتان جيم 13 بروتين أرابينوجالاكتان جيم 15 بروتين أرابينوجالاكتان جيم 16 بروتين أرابينوجالاكتان جيم 20 إكستنسين ماك 207 بروتين أرابينوجالاكتان

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. (أ) التمثيل التخطيطي لتسلسل تشذيب الكتلة لإعداد العينة (الكتلة الصفراء) للتقسيم باستخدام الميكروتوم الفائق. أولا ، تتم إزالة كبسولة الجيلاتين (1). ثم يتم قصها أولا بزاوية 40 درجة إلى 45 درجة على جانبي الكبسولة بشكل عرضي للعينة (2) ، ويتم إجراء قطع ثان عند 90 درجة من الأول (3) متبوعا بثالث (4) والرابع باتباع نفس القاعدة (5). من هذه المرحلة الأولى من التشذيب ينتج هيكل هرمي الشكل يقع...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 8 آبار شرائح تفاعل زجاجية مارينفيلد MARI1216750 يمكن استخدام ماركات أخرى ينتج الأجسام المضادة IgG المضادة للفئران (جزيء الجرذ) - FITC في الماعز سيجما ألدريتش F6258 زلات الغطاء، 24 مم × 50 مم مارينفيلد MARI0100222 يجب أن تغطي زلة الغطاء جميع الآبار. يمكن استخدام ماركات أخرى ddH₂O نا نا الإيثانول المطلق نا نا مضيء الفلورسنت 28 سيجما ألدريتش إف -6259 حليب جاف خالي الدسم نستله نا أي حليب جاف خالي الدسم كاف فرن نا نا فرن مختبر عام أنتجت الفئران أحادية النسيلة المضادة للأجسام مجسات النبات نا تتوفر العديد من الأجسام المضادة التي تتعرف على مكونات جدار الخلية في كل من مركز أبحاث الكربوهيدرات المعقدة (CCRC ، جامعة جورجيا بالولايات المتحدة الأمريكية) ومجسات النبات (مختبر جدار خلية بول نوكس ، في جامعة ليدز بالمملكة المتحدة). يتم عرض قائمة قصيرة ببعض MABS شائعة الاستخدام وأين يمكن شراؤها في الجدول التكميلي 1 مجهر التألق المستقيم مع مرشحات الأشعة فوق البنفسجية و FITC لايكا ميكروسيستمس DMLb غرفة الفراغ نا نا مضخة الفراغ نا نا فيكتاشيلد مختبرات فيكتا تي -1000 يمكن استخدام مضادات التلاشي الأخرى. يرجى التحقق من التوافق مع FITC و Fluorescente brightner 28. (ملاحظة: للحصول على بديل غير تجاري ، (انظر Jonhson et al 198218) يمكن عمل وسط مضاد للتلاشي عن طريق خلط 25 مجم / مل من 1،4-Diazobicyclo- (2،2،2) أوكتان (DABCO) في 9: 1 (v / v) glycerol إلى 1xPBS. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.6 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المخفف.)