استخدام شطيرة ELISA لتحديد محتوى البروتين السكري المناعي في اللقاح

الملخص

المصدر: Jallet ، C. et al. ، اختبار ELISA في المختبر لتقييم فاعلية لقاح داء.J. Vis. Exp. (2020)

يعرض هذا الفيديو مقايسة الممتز المناعي غير المباشر المرتبط بالإنزيم أو مقايسة الالتقاط المناعي لساندويتش ELISA المصممة لتقييم مستويات البروتين السكري المناعي في اللقاحات. يتم تحضين لوحة الفحص ، التي تحتوي على أجسام مضادة خاصة بالبروتين السكري ، بعينات لقاح مخففة بشكل متسلسل ، بما في ذلك اللقاحات المرجعية والاختبارية ، متبوعة بالمقايسة المناعية لتحديد محتوى البروتين السكري في لقاح الاختبار.

البروتوكول

1. احتياطات أمنية

ملاحظة: هذه الطريقة قابلة للتطبيق على كل من فيروس داء الحي (RABV) واللقاح المعطل.

1. استخدم الممارسات المختبرية الجيدة وإجراءات السلامة.
2. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بما في ذلك المعطف والقفازات والأقنعة والنظارات التي تستخدم لمرة واحدة وما إلى ذلك.
3. عندما يتم معايرة الفيروس الحي ، استخدم خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
   1. ضع في اعتبارك أي مادة ملامسة للعينات (الكواشف ، محاليل الغسيل ، إلخ) كمواد معدية.
   2. عالج المادة الملوثة عن طريق غمرها في محلول التبييض (2,5٪ من هيبوكلوريت الصوديوم) لمدة 30 دقيقة لإزالة التلوث.
4. التعامل مع المواد الكيميائية وفقا للممارسات المختبرية الجيدة.

< p class = "jove_title" >2. التحضير

1. استخدم الكواشف التحليلية حيثما أمكن ذلك.
2. قم بإعداد محاليل جديدة للمخزن المؤقت للطلاء / المخزن المؤقت للتخميل ، ومخزن التخميل ، والمخفف ، والمخزن المؤقت للسترات (الجدول 1) ، والترشيح من خلال مرشحات 0.45 أو 0.22 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة يوم واحد قبل الاستخدام للحفاظ على نقائها التحليلي.
3. اسمح للكواشف بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة (+18 درجة مئوية إلى +25 درجة مئوية) قبل 30 دقيقة من الاستخدام وتجانسها عن طريق الخلط اللطيف قبل الاستخدام.

فئة

3. حساسية الصفيحة الدقيقة

ملاحظة: استخدم 96 لوحة مقايسة مناعية لامتصاص البئر تم تحسينها لربط كميات كبيرة من الغلوبولين المناعي (على سبيل المثال ، انظر جدول المواد).

1. أضف إلى كل بئر 200 ميكرولتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة (mAb-D1) المخفف في المخزن المؤقت للكربونات. < / > ملاحظه: تم تحديد التركيز الأمثل لحوالي 1 ميكروغرام / مل تجريبيا ويتوافق مع تخفيف تقريبي 1/2000 من mAb-D1 المنقى. يشار إلى هذا التركيز الموصى به لكل دفعة mAb-D1 ويجب التحقق منه بشكل دوري مع التحكم الإيجابي.
2. قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق واحتضان الصفيحة الدقيقة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية في جو رطب.
3. قم بشفط محتوى البئر بعناية ونقله إلى متلقي يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2,5٪.
4. اقلب الصفيحة الدقيقة واتركها تجف على ورق ماص في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.

فئة

4. تخميل الصفيحة الدقيقة

1. أضف إلى كل بئر 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخميل.
2. قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. استنشق بعناية وانقل محتوى البئر إلى متلقي يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2,5٪.
4. اقلب الصفيحة الدقيقة واتركها تجف على ورق ماص في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
   ملاحظه: يمكن استخدام الصفيحة الدقيقة على الفور أو تخزينها محكمة الغلق عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر حتى الاستخدام.

5. اختبار ELISA

ملاحظة: لتحديد منحنى التحكم في اللقاح المرجعي ، الخطوة 5.3 غير مطلوبة ؛ لمعايرة اللقاح المختبر ، من الضروري إجراء جميع الخطوات من 5.1 إلى 5.6.

1. غسل الصفيحة الدقيقة الحساسة
   1. أضف إلى كل بئر 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل.
   2. استنشق بعناية وانقل محتوى البئر إلى متلقي يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2,5٪.
   3. كرر الخطوتين 5.1.1 و 5.1.2 خمس مرات أخرى لغسل اللوحة الحساسة على نطاق واسع.
   4. اقلب الصفيحة الدقيقة واتركها تجف على ورق ممتص في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
2. تخفيفات اللقاح المرجعي لمنحنى التحكم
   1. إعادة تكوين اللقاح المرجعي (مستضد التحقق من الصحة Lot 09) في 1 مل من الماء المقطر المقابل لتركيز 10 ميكروغرام / مل من البروتين السكري لفيروس داء.
   2. إعداد تخفيف عشرة أضعاف للقاح المرجعي المعاد تكوينه في المخفف للوصول إلى 1 ميكروغرام / مل من البروتين السكري لفيروس داء.
   3. إعداد 6 تخفيفات متسلسلة مزدوجة من هذا اللقاح المرجعي في المخفف كما هو موضح في الجدول 1.
   4. توزيع 200 ميكرولتر من المخفف في نسختين (آبار 1H / 2H) لتكون بمثابة عنصر تحكم فارغ.
   5. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من كل تخفيف للقاح المرجعي في نسختين (الآبار G1/G2 إلى A1/A2).
3. تخفيفات اللقاح المختبر لمعايرة حجمه
   1. قم بإعداد تخفيف عشرة أضعاف للقاح المختبر في المخفف.
   2. إعداد 7 تخفيفات تسلسلية مزدوجة للقاح المختبر في المخفف كما هو موضح في الجدول 2.
   3. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من كل تخفيف لقاح تم اختباره في نسختين (الآبار H3/H4 إلى A3/A4).
4. حضانة / غسل لوحة ELISA
   1. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة بغشاء لاصق واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
   2. قم بإزالة الفيلم والاستنشاق بعناية ونقل محتوى كل بئر إلى متلقي يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2,5٪.
   3. أضف إلى كل بئر 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.
   4. استنشق بعناية وانقل محتوى كل بئر إلى متلقي يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2,5٪.
   5. كرر الخطوتين 5.4.3 و 5.4.4 خمس مرات لإزالة المستضد غير المرتبط والحفاظ على أدوات تشذيب بروتين G المرتبطة بالجسم المضاد المطلي (mAb D1).
   6. اقلب الصفيحة الدقيقة واتركها تجف على ورق ماص في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
5. ربط البيروكسيداز المترافق mAb-D1
   1. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من التخفيف الموصى به (1/2000) من mAb-D1 المسمى بالبيروكسيداز في المخفف (التركيز التقريبي 1 ميكروغرام / مل). يشار إلى التركيز الموصى به لكل دفعة mAb-D1 ويجب التحقق منه بشكل دوري مع التحكم الإيجابي.
   2. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة بغشاء لاصق واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
   3. قم بإزالة الفيلم والاستنشاق بعناية ونقل محتوى كل بئر إلى متلقي يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2,5٪.
   4. أضف إلى كل بئر ، 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت.
   5. استنشق بعناية وانقل محتوى كل بئر إلى متلقي يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2,5٪.
   6. كرر الخطوتين 5.5.4 و 5.5.5 خمس مرات لإزالة الجسم المضاد غير المرتبط بعلامة البيروكسيديز (mAb D1).
   7. اقلب الصفيحة الدقيقة واتركها تجف على ورق ماص في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
6. الوحي باستخدام الركيزة كروموجين
   1. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من محلول الركيزة الكروموجين.
   2. أغلق الصفيحة الدقيقة بفيلم واحتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. يتطور اللون الأصفر البرتقالي الذي تتناسب شدته مع كمية الأجسام المضادة المرتبطة بالبيروكسيداز (mAb D1).
   3. أوقف التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر من محلول التوقف لكل بئر.
   4. امسح الجزء السفلي من الصفيحة الدقيقة بعناية وضعه في مقياس الطيف الضوئي لتحديد الكثافة الضوئية (OD) عند 492 نانومتر لجميع الآبار المستخدمة: التحكم السلبي (فارغ) ، واللقاح المرجعي ، واللقاح المختبر.
   5. جمع بيانات OD بتنسيق ملف .xls أو .xlsx لتحليلها.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. المخازن المؤقتة المستخدمة في المقايسة.

المخازن المؤقتة والكواشف اعداد طلاء العازلة
(عازلة الكربونات 50 ملي مولار درجة الحموضة = 9.6) أضف كربونات الصوديوم 50 ملي مولار (Na₂CO 3-10H₂O) إلى بيكربونات الصوديوم 50 ملي مولار (NaHCO₃) حتى درجة الحموضة المطلوبة (حوالي 1/10 حجم بيكربونات الصوديوم) المخزن المؤقت للتخميل 0.3٪ ألبومين مصل بقري (BSA ، الكسر V) ، 5٪ سكروز في محلول كربونات 50 ملي مولار درجة الحموضة 9.6 10x الرقم الهيدروجيني الملحي المخزن بالفوسفات = 7 (PBS 10x) كلوريد الصوديوم 80 جم ، KCl 2 جم ، Na₂PO 4-12H₂O 11.33 جم ، KH₂PO₄ 2 جم في 1 لتر من الماء المقطر. اضبط الأس الهيدروجيني = 7 باستخدام 4N هيدروكسيد الصوديوم عازلة الغسيل 0.05٪ توين في 1x PBS مخفف 0.5٪ ألبومين مصل البقر (الكسر V) ، 0.05٪ توين في 1x PBS (اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7 بسبب التحمض بواسطة BSA) عازلة السترات pH-5.6
(لركيزة البيروكسيديز) 11.67 جم سترات ثلاثي الصوديوم -2 ساعة₂O (Na₃C₆H₅O_{7-2H 2}0) ، 2.17 جم حامض الستريك -1H20 في 1 لتر من الماء المقطر محلول الركيزة الكروموجين 50 مجم قرص أورثو فينيلين ديامين ، 0.1٪ بيروكسيد الهيدروجين 30٪ (110 مجلد) في 25 مل سترات الدرجة الحموضة 5.6 حل التوقف
(4N حمض الكبريتيك) 10 مل H2SO4 36N في 80 مل من الماء المقطر المبرد. يجب أن يتم التخفيف في حمام جليدي

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ثيرموفيشر العلمي 10445753 في حالة معايرة الفيروس الحي ألواح شفافة مسطحة القاع مناعية غير معقمة 96 بئر ، 400 ميكرولتر ، MAXISORP ثيرموفيشر العلمي 439454 جيد للارتباط بالجسم المضاد المحمل تجهيز Labo مختبر البولي بروبلين الدخان هود ثيرموفيشر العلمي 12576606 لإعداد حامض الكبريتيك لوحة المناعة قوية
الامتزاز MAXISORP قاع مسطح
بئر F96 دوتشر 55303 جيد للارتباط بالجسم المضاد المحمل شريط ختم Microplate (100 ورقة) ثيرموفيشر العلمي 15036 [م] قارئ وضع واحد Microplate شروق الشمس تيكان حاضنة شاكر Microplate دوتشر 441504 غسالة Microplate Wellwash ثيرموفيشر العلمي 5165000 ماصة متعددة القنوات (30-300 ميكرولتر) 12 قناة ثيرموفيشر العلمي 4661180 نيوت الماصات أحادية القناة (المجموعة 2: Finnpipettes F2 0.2-2 ميكرولتر ميكرو ، 2-20 ميكرولتر ، 20-200 ميكرولتر & 100-1000 ميكرولتر) ثيرموفيشر العلمي 4700880