مقالة منهجية

الالتقاط المناعي وقياس التدفق الخلوي للحويصلات خارج الخلية لتوصيف المستضدات

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Arakelyan، A. et al. ، قياس الفيروسات للتدفق لتحليل الأطياف المستضدية للفيروسات والحويصلات خارج الخلية.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو التقاط المناعة للحويصلات خارج الخلية باستخدام اقتران الجسيمات النانوية المغناطيسية للأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت. تتضمن العملية تكوينا معقدا ، وتلوين بأجسام مضادة للكشف المسمى بالفلورسنت ، والفصل المغناطيسي ، وتحليل التدفق الخلوي لتوصيف المستضد.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. اقتران الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNPs)

  1. استخدم إجراء الاقتران التجاري والكواشف لإقران MNPs بالأجسام المضادة (Abs) (عادة 1 مجم). يتم استخدام جزيئات أكسيد الحديد النانوية مع حمض الكربوكسيل كمجموعات تفاعلية.
    1. إذا كانت الأجسام المضادة بحجم أعلى من 0.5 مل ، فقم بالتركيز باستخدام مكثف 100 كلفن. تدور في 2,000 × جم لمدة 3-5 دقائق.
  2. في نهاية الإجراء ، بعد إضافة 10 ميكرولتر من مخزن التبريد ، انقل MNPs إلى أنبوب 12 مم × 75 مم وأضف 3 مل من المخزن المؤقت للغسيل / التخزين. ضع الأنبوب في الفتحة المركزية للفاصل المغناطيسي واتركه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  3. تحقق من أن MNPs قد تجمعت جميعها على جانب الأنبوب ، ثم قم بإخراج كل السائل بعناية. أضف 3 مل من المخزن المؤقت للغسيل / التخزين الطازج ، ثم ضعه مرة أخرى في المغناطيس.
  4. بعد عدة ساعات ، تحقق مما إذا كان MNPs قد تم جمعه على جانب الأنبوب ثم قم بسحب السائل. استخدم 2 مل من المخزن المؤقت للغسيل / التخزين لإعادة تعليق MNPs وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  5. تحقق من أن Abs مقترن ب MNPs عن طريق تصنيفها بجزء من الجسم المضاد الفلوري Fab ذي الصلة (على سبيل المثال ، الماعز المضاد للفأر إذا كنت تستخدم فأر أحادي النسيلة Ab للالتقاط كما هو موضح في القسم 2) وقم بتشغيله على مقياس التدفق الخلوي.
< p class = "jove_title" >2. وضع العلامات على الأجسام المضادة المقترنة ب MNPs

  1. اجمع بين 60 ميكرولتر (3.9 × 1012 جسيما) من MNPs (لكل حالة) و 5 ميكرولتر (من محلول تجاري 200 ميكروغرام / مل) شظايا Fab المسماة ، خاصة بالنمط الإسوي للالتقاط Ab في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  2. احتضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة مع الخلط المستمر.
  3. قم ببللة مكثف 100 كلفن مسبقا ب 300 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وقم بالدوران في جهاز طرد مركزي دقيق عند 1,500 × جم لمدة 5 دقائق.
  4. تنقية المجمعات المسماة على عمود 100K. قم بتدوير الخليط من الخطوة 2.2 في جهاز طرد مركزي دقيق عند 1,500 × جم لمدة 5 دقائق ، واغسله ب 200 ميكرولتر PBS ، واسترجع في الحجم الأولي.
< p class = "jove_title" >3. استخدام مجمعات ab-MNP المسمى لالتقاط الجسيمات ذات الأهمية (الحويصلات خارج الخلية ، EVs)

  1. احتضان MNPs المسمى مسبقا 60 ميكرولتر (3.9 × 1012 جسيما) مع تحضير EV (100 ميكرولتر).
    1. تحضير مستحضرات المركبات الكهربائية بطرق مختلفة. هنا ، قم بتنقية المركبات الكهربائية على تدرجات السكروز ، واجمعها من البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية باستخدام كواشف ترسيب الإكسوسوم أو عزلها مباشرة من البلازما. < / > ملاحظه: يجب تحديد النسب المثلى لكل تجربة وتعتمد على تركيز EV في التحضير. يجب أن يكون جزء MNP-Ab ~ 106 زائدا مقارنة بتركيز جزء EV.
  2. احتضان 1 ساعة عند 4 درجات مئوية للمركبات الكهربائية.
  3. أضف 2.5٪ IgG / IgG البشري للفأر لمنع ربط Fc ، دوامة برفق ، احتضان 3-5 دقائق في RT.
  4. أضف تركيزات الشركة المصنعة الموصى بها أو المعيار لكل كشف عن القيمة المطلقة واحتضان 20 دقيقة إضافية في RT.

4. فصل المركبات الكهربائية التي تم التقاطها بواسطة MNP عن الأجسام المضادة غير المنضمة باستخدام الأعمدة المغناطيسية

  1. قم بإعداد عمود الفصل المغناطيسي للاستخدام عن طريق وضعه في مغناطيس فاصل.
  2. قم بترطيب العمود مسبقا ب 500 ميكرولتر من محلول الغسيل (2 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS). اسمح للمخزن المؤقت للغسيل بالتدفق عبر العمود.
  3. أضف مجمعات MNP-EV إلى العمود واسمح لكل السائل بالتدفق من خلاله. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى العمود ، مما يسمح بمرور الحجم بالكامل.
  4. كرر الغسيل باستخدام عازلة الغسيل مرتين أخريين.
  5. قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه في أنبوب 12 مم × 75 مم لتجميع مجمعات MNP-EV المحتجزة. دع العمود يقف في الأنبوب بعيدا عن المغناطيس لمدة 3 دقائق. أضف 200 ميكرولتر من PBS واترك الخرز يتدفق لأسفل عن طريق الجاذبية ، وأضف 200 ميكرولتر أخرى من PBS ، وثبته ب 200 ميكرولتر 4٪ بارافورمالدهيد بعد الشطف.
    ملاحظه: بارافورمالدهيد هو مادة مسرطنة مشتبه بها ويجب التعامل معها في غطاء جيد التهوية ويجب ارتداء القفازات.
  6. لتحديد المركبات الكهربائية الفردية ، استخدم الإعدادات الحجمية على جهاز أخذ العينات عالي الإنتاجية (HTS) أو قبل الاستحواذ مباشرة ، أضف حبات عدد قياس التدفق الخلوي المختلطة جيدا.

5. تحليل المركبات الكهربائية التي تم التقاطها بواسطة MNPs باستخدام مقياس التدفق الخلوي

  1. قم بتسخين مقياس التدفق الخلوي لمدة 30 دقيقة.
  2. تشغيل حبات مراقبة الجودة.
  3. حدد عتبة مضان إما MNPs أو المركبات الكهربائية المصنفة. استخدم 0.22 ميكرومتر PBS مفلتر للعتبة لتقليل "الضوضاء" في الخلفية. اضبط العتبة عن طريق ضبط جهد PMT عند المستوى الذي لا يعطي فيه PBS المصفى أي أحداث أو عدد قليل جدا منها.
  4. تشغيل العينات على مستوى منخفض. (استخدم مرشحا مضمنا إضافيا 0.04 ميكرومتر لسائل الغلاف الموضوع في سلسلة خلف مرشح الغلاف القياسي 0.2 ميكرومتر للقضاء على الأحداث الكاذبة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المواد أطقم اقتران الجسيمات النانوية لأكسيد الحديد المغناطيسي من الكربوكسيل المحيط نانوتك ICK-15-005 وحدة تصفية الطرد المركزي Amicon Ultra-4 مع غشاء Ultracel-100 ميليبور UFC810024 5 مل أنبوب اختبار PP القاع المستدير ، بدون غطاء صقر 352002 المياه المعالجة DEPC جودة البيولوجية 351-068-131 فاصل مغناطيسي SuperMAG-01 المحيط نانوتك سوبر ماج -01 طقم وضع العلامات Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 ثيرمو فيشر العلمي الطراز Z25055 أجهزة الطرد المركزي Nanosep مع غشاء أوميغا 100 كيلو شركة بال OD100C34 EDTA 0.5 م كورنينج سيلجرو 46-034-CI محلول ألبومين مصل البقر سيجما ألدريتش A9576-50 مل برنامج تلفزيوني جيبكو 10010-23 بارافورمالديهايد ، درجة EM ، منقى EMS 15710 [م] 123 قطعة eBeads العلوم البيولوجية الإلكترونية 01-1234-42 حبات CytoCount داكو S2366 حبات AccuCheck عد إنفيتروجين ثنائي الفينيل متعدد الكلور 100 مجموعة إعداد وتتبع الخرز للمقياس الخلوي (CST) BD Bioscience 642412 معدات عمود μMACS ميلتيني بيوتيك 130-042-701 OctoMACS فاصل المغناطيس ميلتيني بيوتيك 130-042-108 نانودروب ثيرموفيشر اي نانوسايت NS300 مالفيرن اي مقياس التدفق الخلوي BD LSRII BD Bioscience اي برمجيات برنامج Flowjo فلونجو برنامج BD FACSDiva دينار بحريني

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة