اختبار مناعي متعدد الإرسال قائم على الخرزة لتحديد أهداف السيتوكين المتعددة

الملخص

المصدر: Lehmann، J. S.، et al. تعدد التنميط السيتوكين لخلايا الطحال المحفزة في الفئران باستخدام منصة المقايسة المناعية القائمة على الخرزة الخلوية. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو اختبارا مناعيا متعدد الإرسال قائم على الخرزة لتحديد أهداف السيتوكين المتعددة في العينة. يتم استخدام مزيج من الكريات المجهرية المميزة المقترنة بالأجسام المضادة الخاصة بالسيتوكين لربط السيتوكينات الموجودة في العينة. يتم تثبيت المراسلين الموسومين بالستربتافيدين على السيتوكينات المرتبطة باستخدام الأجسام المضادة للكشف عن البيوتينيل. يحدد قياس التدفق الخلوي السيتوكينات المرتبطة بناء على الأحجام الفريدة وشدة التألق الداخلي للكريات المجهرية ، بينما تشير شدة التألق للمراسلين إلى عدد السيتوكينات.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير العينة البيولوجية

ملاحظة: يترك الموقع التشريحي المختار وحجم جمع الدم لتقدير كل محقق على حدة ولن يؤثر على نتيجة الفحص. ومع ذلك ، بمجرد الحصول عليها ، يجب التعامل مع العينات وفقا للخطوات المذكورة أدناه.

1. تحضير عينات المصل
   1. اجمع الحجم المطلوب من الدم في أنبوب التجميع المفضل واتركه يتجلط لمدة 30 دقيقة على الأقل.
   2. الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق عند 1,000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
   3. قم بإزالة المصل والمقايسة على الفور أو في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المصنوعة من مادة البولي بروبيلين وتخزين العينات عند ≤ -20 درجة مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات جهاز الطرد المركزي Allegra 6R مع محول MICROPLUS Carrier بيكمان كولتر 366816 بالنسبة إلى LEGENDplex ، يتم تشغيل فحوصات LEGENDplex في الأنابيب الدقيقة ، لوحة 96 بئر على شكل حرف V أو U (اختياري) LEGENDplex Mouse T مساعد لوحة السيتوكين بيو ليجند 740005 المقايسة المناعية المتعددة (13-plex) الجسم المضاد CD3ε المضاد للفأر بيو ليجند 100314 استنساخ 145-2C11 ، سموم داخلية منخفضة ، تنسيق خال من الأزيد الجسم المضاد CD28 المضاد للفأر بيو ليجند 102112 استنساخ 37.51 ، توكسين داخلي منخفض ، تنسيق خال من الأزيد مضخة فراغ EMD ميليبور WP6111560 لمقايسات LEGENDplex باستخدام لوحات الترشيح (موصى به) مشعب الفراغ EMD ميليبور MSVMHTS00 لمقايسات LEGENDplex باستخدام لوحات الترشيح (موصى به) خزانات كاشف معقمة يمكن التخلص منها فيشر ساينتيك 07-200-130 أو ما يعادلها أنابيب البولي بروبلين MicroFACS فيشر ساينتيك 11-842-90 بالنسبة إلى LEGENDplex ، يتم تشغيل فحوصات LEGENDplex في الأنابيب الدقيقة ، لوحة 96 بئر على شكل حرف V أو U (اختياري) طقم الماصات فيشر ساينتيك 14-388-100 أربعة أحجام ماصات (0.2-2 ميكرولتر، 2-20 ميكرولتر، 20-200 ميكرولتر، 100-1000 ميكرولتر) ماصة متعددة القنوات فيشر ساينتيك FA10011G قادرة على توزيع 5 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر شاكر ميكروبليت فيشر ساينتيك 88880023 أو ما يعادلها أجهزة الطرد المركزي الدقيقة فيشر ساينتيك 75002410 أو ما يعادلها أنابيب FACS فيشر ساينتيك NC9885747 قاع دائري 12 × 75 مم PMA (فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات) سيجما ألدريتش ص 8139 عديد السكاريد الدهني (LPS) سيجما ألدريتش L-8274 الإشريكية القولونية O26: B6 الأيونومايسين سيجما ألدريتش أ 0634 منظف برانسون B200 بالموجات فوق الصوتية سيجما ألدريتش Z305359 أو ما يعادلها أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سيجما ألدريتش Z666505 1.5 مل أنابيب البولي بروبلين مقياس التدفق الخلوي مختلف مختلف مقياس الخلوي مزود بليزر واحد (488 نانومتر أزرق) أو ليزرين (488 نانومتر أزرق أو 532 نانومتر أخضر + 633 نانومتر أحمر) قادر على قراءة الأطوال الموجية للانبعاث عند 575 نانومتر و 660 نانومتر 96 بئر لوحة البولي بروبلين VWR 82050-662 بالنسبة إلى LEGENDplex ، يتم تشغيل فحوصات LEGENDplex في الأنابيب الدقيقة ، لوحة 96 بئر على شكل حرف V أو U (اختياري)