اختبار مناعي متعدد الإرسال قائم على الخرزة لتحديد أهداف السيتوكين المتعددة

الملخص

المصدر: Lehmann، J. S.، et al. تعدد التنميط السيتوكين لخلايا الطحال المحفزة في الفئران باستخدام منصة المقايسة المناعية القائمة على الخرزة الخلوية. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو اختبارا مناعيا متعدد الإرسال قائم على الخرزة لتحديد أهداف السيتوكين المتعددة في العينة. يتم استخدام مزيج من الكريات المجهرية المميزة المقترنة بالأجسام المضادة الخاصة بالسيتوكين لربط السيتوكينات الموجودة في العينة. يتم تثبيت المراسلين الموسومين بالستربتافيدين على السيتوكينات المرتبطة باستخدام الأجسام المضادة للكشف عن البيوتينيل. يحدد قياس التدفق الخلوي السيتوكينات المرتبطة بناء على الأحجام الفريدة وشدة التألق الداخلي للكريات المجهرية ، بينما تشير شدة التألق للمراسلين إلى عدد السيتوكينات.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير العينة البيولوجية

ملاحظة: يترك الموقع التشريحي المختار وحجم جمع الدم لتقدير كل محقق على حدة ولن يؤثر على نتيجة الفحص. ومع ذلك ، بمجرد الحصول عليها ، يجب التعامل مع العينات وفقا للخطوات المذكورة أدناه.

1. تحضير عينات المصل
   1. اجمع الحجم المطلوب من الدم في أنبوب التجميع المفضل واتركه يتجلط لمدة 30 دقيقة على الأقل.
   2. الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق عند 1,000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
   3. قم بإزالة المصل والمقايسة على الفور أو في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المصنوعة من مادة البولي بروبيلين وتخزين العينات عند ≤ -20 درجة مئوية.
2. تحضير عينات البلازما
   1. اجمع الحجم المطلوب من الدم باستخدام أنابيب جمع الدم المطلية بحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
   2. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 1,000 × جم في درجة حرارة الغرفة في غضون 30 دقيقة من التجميع.
   3. قم بإزالة البلازما والفحص على الفور ، أو قم بتقطيعها إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المصنوعة من مادة البولي بروبلين وتخزين العينات عند ≤ -20 درجة مئوية.
3. تحضير عينات طافية زراعة الأنسجة
   1. قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق عند 1,500 × جم عند 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا والحطام.
   2. اجمع المادة الطافية والفحص على الفور أو في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من مادة البولي بروبيلين وتخزينها في درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية.
4. إذابة العينات البيولوجية المجمدة
   1. قم بإذابة أي عينات بيولوجية مجمدة مسبقا تماما على الجليد والدوامة لفترة وجيزة قبل الاستخدام. تجنب أكثر من 2 دورات تجميد / ذوبان.
      ملاحظه: تم الحصول على العينات المستخدمة في هذا البروتوكول عن طريق زراعة خلايا طحال الفئران BALB / c (1 × 10⁶ خلايا عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} في ظل ظروف مختلفة: غير محفز ، LPS (100 نانوغرام / مل) ، αCD3 (1 ميكروغرام / مل مطلي بالألوان) + αCD28 (1 ميكروغرام / مل قابل للذوبان) ، PMA (20 نانوغرام / مل) + أيونوميسين (500 نانوغرام / مل). تم جمع المواد الطافية المزرعة بعد 48 ساعة ومعالجتها كما هو موضح في القسم 1.3.

2. تحضير الكاشف

1. تحضير حبات الأجسام المضادة المختلطة مسبقا
   1. زجاجة حبات Sonicate مخلوطة مسبقا لمدة 1 دقيقة في حمام صوتي في درجة حرارة الغرفة ، ثم دوامة لمدة 30 ثانية قبل الاستخدام. إذا لم يكن هناك حمام صوتي متاح ، فقم بزيادة وقت الدوامة إلى 1 دقيقة.
2. تحضير عازلة الغسيل
   1. أحضر 20x Wash Buffer (20x PBS مع 1٪ Tween-20) المرفق مع المجموعة إلى درجة حرارة الغرفة والدوامة لإحضار جميع الأملاح إلى المحلول.
   2. خفف 25 مل من محلول الغسيل 20x مع 475 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بتخزين الأجزاء غير المستخدمة بين 2 درجة مئوية و 8 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
3. تحضير المصفوفة B (للاستخدام مع عينات المصل والبلازما فقط)
   1. أضف 5.0 مل من المخزن المؤقت للفحص (PBS مع 1٪ BSA) المضمن في المجموعة إلى الزجاجة التي تحتوي على Matrix B المجفف بالتجميد ، اترك 15 دقيقة على الأقل لإعادة التكوين الكامل ، ثم الدوامة حتى تمتزج جيدا. يمكن تخزين بقايا المصفوفة B المعاد تشكيلها عند ≤ -70 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

< p class = "jove_title" >3. الإعداد القياسي

ملاحظة: يحتوي كل مادة تحليلية في هذه اللوحة على تركيز قياسي أعلى يبلغ 10,000 بيكوغرام / مل.

1. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص لإعادة تكوين كوكتيل Mouse Th Cytokine القياسي المجفف. امزج عن طريق الدوامة لفترة وجيزة واترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
2. انقل الكوكتيل القياسي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق من مادة البولي بروبلين تحمل علامة "C7". سيتم استخدام هذا كأعلى معيار.
3. قم بتسمية 6 أنابيب طرد مركزي دقيق من مادة البولي بروبلين مثل C6 و C5 و C4 و C3 و C2 و C1.
4. أضف 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى كل من هذه الأنابيب.
5. انقل 25 ميكرولتر من C7 القياسي الأعلى إلى أنبوب C6 واخلطه جيدا عن طريق الدوامة. سيكون هذا هو معيار C6.
6. استمر في إجراء التخفيفات التسلسلية 1: 4 باستخدام طرف ماصة جديد لكل أنبوب لإضافة 25 ميكرولتر من المعيار السابق إلى 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص في أدنى أنبوب قياسي تالي ، متبوعا بالدوامة للحصول على المعايير C5 و C4 و C3 و C2 و C1. استخدم المخزن المؤقت للفحص كمعيار 0 بيكوغرام/مل (C0).

< p class = "jove_title" >4. تخفيف العينة

ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى تجارب تجريبية أولية باستخدام هذا الاختبار مع تخفيفات متعددة لتحديد عامل التخفيف الأنسب لمجموعة معينة من العينات البيولوجية. سينتج عن عامل التخفيف المناسب حسابات تركيز للعينة التي تقع ضمن حدود المنحنى القياسي. المقصود بالخطوات التالية كمبادئ توجيهية وقد يتعين تحديدها تجريبيا اعتمادا على نوع العينة.

تخفيف
1. عينات المصل أو البلازما 2 أضعاف مع المخزن المؤقت للفحص (على سبيل المثال ، تخفيف 50 ميكرولتر من العينة مع 50 ميكرولتر من محلول الفحص) في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة من مادة البولي بروبلين.
   ملاحظه: إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من تخفيف العينة ، فيجب إجراء التخفيفات باستخدام المصفوفة B بدلا من المخزن المؤقت للفحص لضمان القياس الدقيق. ستؤدي إضافة عينات المصل أو البلازما دون تخفيف إلى انخفاض دقة الفحص وقد تسد لوحة المرشح. يتكون المصفوفة B من مصل الفأر المجمع المستنفد من أهداف الفحص الذاتية. يتم استخدامه كمخفف لعينة المصل أو البلازما لتجنب تأثيرات المصفوفة ، والتي من المعروف أنها تؤثر على الحساسية التحليلية للمقايسات المناعية.
2. اختبار عينات طافية ثقافة الخلايا بدون تخفيف.
   ملاحظه: يمكن أن تختلف مستويات التحليل اختلافا كبيرا من عينة إلى أخرى. إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف عينات الطاف باستخدام تحضير جديد لوسط زراعة الخلايا المقابل لها أو المخزن المؤقت للمقايسة.

< p class = "jove_title" >5. إجراء الفحص

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يمكن إجراء الاختبار في ألواح ترشيح البولي بروبلين ، أو أنابيب فرز الخلايا المنشطة بالفلورة الدقيقة (FACS) ، أو الصفائح الدقيقة ذات القاع على شكل V. يوصى بإجراء فحص لوحة الترشيح نظرا للاتساق الجيد من عينة إلى عينة ، ومتانة الفحص ، وسهولة التعامل معها. يتطلب هذا الإجراء وحدة ترشيح فراغ للغسيل (يوفرها المستخدم النهائي).

1. اترك جميع الكواشف تسخن إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) قبل الاستخدام.
2. اضبط لوحة المرشح على غطاء لوحة مقلوب في جميع الأوقات أثناء إعداد الفحص وخطوات الحضانة بحيث لا يلمس الجزء السفلي من اللوحة أي أسطح ، حيث قد يتسبب في حدوث تسرب.
3. احتفظ باللوحة في وضع مستقيم أثناء إجراء الفحص بأكمله ، بما في ذلك خطوات الغسيل ، لتجنب فقدان الخرز.
4. احتفظ باللوحة في الظلام أو ملفوفة بورق الألمنيوم لجميع خطوات الحضانة.
5. قم بتشغيل جميع المعايير والعينات كنسخ مكررة مرتبة على اللوحة بترتيب تسلسلي.
6. قم بترطيب لوحة المرشح مسبقا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 1x Wash Buffer إلى كل بئر واتركها لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة (في حالة استخدام صفيحة صغيرة أسفل المرشح).
7. قم بإزالة حجم المخزن المؤقت باستخدام مشعب التفريغ (5 - 10 ثوان). لا تتجاوز 10 زئبق من الفراغ. امسح عازلة الغسيل الزائدة من أسفل اللوحة عن طريق الضغط على اللوحة على كومة من المناشف الورقية النظيفة. ضع اللوحة فوق غطاء اللوحة المقلوبة.
   ملاحظه: قد يتم حذف الخطوات 5.1 - 5.2 إذا تم إجراء الفحص باستخدام صفيحة دقيقة على شكل حرف V أو أنابيب FACS دقيقة.
8. بالنسبة لعينات الطافف لزراعة الخلايا ، أضف 25 ميكرولتر من محلول الفحص إلى جميع الآبار. أضف 25 ميكرولتر من كل معيار إلى الآبار القياسية. أضف 25 ميكرولتر من كل عينة إلى آبار العينة.
9. لقياس عينات المصل أو البلازما ، أضف 25 ميكرولتر من المصفوفة B إلى الآبار القياسية. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى آبار العينة. أضف 25 ميكرولتر من كل معيار إلى الآبار القياسية. أضف 25 ميكرولتر من كل مصل مخفف أو عينة بلازما إلى آبار العينة.
10. حبات Vortex مختلطة لمدة 30 ثانية. أضف 25 ميكرولتر من الخرز المختلط إلى كل بئر ، وهز زجاجة الخرزة بشكل متقطع لتجنب استقرار الخرزة. يجب أن يكون الحجم النهائي 75 ميكرولتر في كل بئر بعد إضافة الخرز.
11. أغلق اللوحة باستخدام مادة مانعة للتسرب من الألواح. لف اللوحة بأكملها ، بما في ذلك غطاء اللوحة المقلوب ، بورق الألمنيوم. ضع الطبق على شاكر اللوحة ، وثبته ، ورجه عند حوالي 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. لمنع التسرب ، لا تضغط إيجابيا على مانع تسرب الألواح.
12. بدون قلب ، ضع اللوحة على مشعب الفراغ ، وقم بتطبيق الفراغ كما كان من قبل وأضف 200 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للغسيل إلى كل بئر.
13. قم بإزالة محتويات آبار لوحة الفحص عن طريق الترشيح الفراغي. امسح عازلة الغسيل الزائدة من أسفل اللوحة باستخدام وسادة ماصة أو مناشف ورقية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
    ملاحظه: إذا تم إجراء الفحص باستخدام صفيحة دقيقة على شكل حرف V أو أنابيب FACS دقيقة ، فتخط الخطوتين 1.12 و 1.13. بدلا من ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة متعددة القنوات.
14. أضف 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف (انظر جدول المواد) إلى كل بئر.
15. أغلق اللوحة بمادة مانعة للتسرب جديدة. لف اللوحة بأكملها ، بما في ذلك غطاء اللوحة المقلوب ، بورق الألمنيوم.
16. ضع الطبق على شاكر اللوحة ورجه عند حوالي 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
17. بدون التنظيف بالمكنسة الكهربائية ، أضف 25 ميكرولتر من كاشف الستربتافيدين فيكوريثرن (SA-PE) مباشرة إلى كل بئر. لا يلزم تخفيف الكاشف.
18. أغلق اللوحة بمادة مانعة للتسرب جديدة. لف اللوحة بأكملها ، بما في ذلك غطاء اللوحة المقلوب ، بورق الألمنيوم.
19. ضع الطبق على شاكر الطبق ورجه عند حوالي 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
20. كرر الخطوة 1.13 أعلاه.
21. أضف 200 ميكرولتر من 1x Wash Buffer إلى كل بئر. أعد تعليق الخرز على شاكر الطبق لمدة 1 دقيقة.
22. باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل العينات من لوحة المرشح إلى أنابيب FACS لقراءة العينات على مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظه: يمكن زيادة حجم العينة من 200 ميكرولتر إلى 300 ميكرولتر عن طريق إضافة 100 ميكرولتر إضافي من 1x Wash Buffer إلى كل أنبوب لتجنب جفاف العينة. إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية ، وحمايتها من الضوء ، وتحليلها في اليوم التالي. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي تخزين العينات لفترات طويلة إلى تقليل الإشارة.

المواد