التحليل القائم على قياس التدفق الخلوي لتنشيط الخلايا المتغصنة باستخدام المجمعات المناعية

Abstract

المصدر: Santana-Magal، N.، et al. بروتوكول عزل الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية للفأر وتنشيطها اللاحق في المختبر مع المجمعات المناعية للورم.J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لتقييم تنشيط الخلايا المتغصنة باستخدام الخلايا السرطانية المغلفة بالغلوبولين المناعي G (IgG). تستوعب الخلايا المتغصنة الخلايا السرطانية المغلفة ب IgG ، وتعالج مستضدات الورم ، وتقدمها على السطح من خلال جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير - II ، جنبا إلى جنب مع التعبير المشترك لجزيء التكلفة CD86. تخضع هذه الخلايا المتغصنة بعد ذلك لتحليل التلوين المناعي المستهدف ب MHC-II و CD86 وتحليل قياس التدفق الخلوي لتحديد حالة تنشيطها.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة

1. عزل الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الوحيدة المرتبطة بالورم

1. في غطاء التدفق الصفحي ، قم بإزالة الأورام من الفئران التي تم قتلها رحيم بثاني أكسيد الكربون₂ وضع الأورام في وسط RPMI بدون مصل بقري الجنين (FBS).
   ملاحظه: يوصى بشدة بحلق الفئران ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل إزالة الأورام لتقليل التلوث المحتمل من الفراء. تأكد من أن الورم لا يتجاوز 25-40 مم² لأن الأورام الأكبر حجما تحتوي على عدد أقل من الخلايا المتغصنة (DC) التي تميل إلى أن تكون هشة وعرضة للخضوع لموت الخلايا. إذا كانت هناك حاجة إلى أعداد أكبر من التيار المستمر ، فيمكن حقن كل فأر بالخلايا السرطانية في مواقع متعددة.
2. تحت غطاء رقائقي معقم ، قم بتقطيع الأورام إلى قطع صغيرة (حوالي 1 × 1 مم²) باستخدام مقص الجراحة.
   1. أضف جميع شظايا الورم من فأر واحد إلى أنبوب معقم مسطح القاع سعة 30 مل مع قضبان تقليب مغناطيسية تحتوي على 5 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، و 2 مجم / مل من الكولاجيناز الرابع ، و 0.01 مجم / مل DNase I.
      أنذر: تنتج الخلايا النخاعية الطاقة من خلال الارتباط بالجليكوزيل ، حتى في حالة مستقرة. لذلك ، استخدم فقط الوسائط التي تحتوي على الجلوكوز (على سبيل المثال ، HBSS ، ومعهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) ، و Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)) ، لأن تجويع الجلوكوز لمدة تقل عن 10 - 15 دقيقة سيؤدي إلى موت الخلايا وموت الخلايا المبرمج في غضون 24 ساعة. استخدم فقط الكولاجيناز الوريدي منخفض السموم الداخلية ، حيث يتم إنتاج الكولاجيناز بواسطة البكتيريا موجبة الجرام (المطثية النسيجية).
3. يقلب عند حوالي 200-400 دورة في الدقيقة في حاضنة 37 ^{درجة مئوية}مع محرك مغناطيسي لمدة 20-30 دقيقة.
4. أضف 5 مل من الوسائط الكاملة وأعد تعليقها بقوة.
5. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي عند 4 ^درجاتمئوية 400 RCF لمدة 5 - 10 دقائق لحبيبات الخلايا. < / > أنذر: لا تحاول عزل الخلايا مباشرة بعد الهضم الأنزيمي، لأن بعض الأورام نخرية وتحتوي على كميات كبيرة نسبيا من بقايا الخلية أو المصفوفة خارج الخلية. قم بتطبيق الخلايا على وسط تدرج كثافة 15٪ للحصول على الخلايا فقط.
6. قم بتعليق 9 مل من وسط تدرج الكثافة مع 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10x (PBS) لضبط الأسمولية والحصول على محلول مخزون Percoll بنسبة 100٪. امزج محلول مخزون متوسط التدرج بكثافة 1.5 مل مع 8.5 مل HBSS واخلطه بقوة مع حبيبات الخلية المشتقة من الورم. ضع طبقة برفق 2 مل من DMEM على الجزء العلوي من وسط تدرج كثافة 15٪ وجهاز طرد مركزي عند 400 RCF لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المواد الطافية ، حيث ستشكل الخلايا حبيبات في قاع الأنبوب.
   1. اغسل الخلايا المحببة مرتين عن طريق إعادة تعليقها في 10 مل HBSS يحتوي على 2٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين و 10 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) (عازل العزل) ، وجهاز الطرد المركزي عند 4 ^درجاتمئوية 400 RCF لمدة 5-10 دقائق لحبيبات الخلايا.
   2. عد الخلايا على مقياس كثافة الدم باستخدام التريبان الأزرق تحت المجهر الضوئي.
7. أعد تعليق 1 × 10⁸ خلايا في عازل عزل 1 مل واحتضانها عند 4 ^درجاتمئوية مع 30 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المترافق CD11b ⁺ لمدة 15 ><دقيقة. تحذير: تجنب استخدام الخرز المترافق CD11c ، لأن هذا سينشط التيار المستمر ويؤدي إلى موت الخلايا. لا تحاول منع FcγRII و FcγRIII بالأجسام المضادة ل CD16 / 32. تمنع الأجسام المضادة تربط FcγR ، وتحفز فسفرة قوية لكينازات البروتين المنشط بالميتوجين (MAP) ، وتهيئة DC.
   1. قم بإزالة الخرزات الزائدة غير المرتبطة بإضافة 9 مل من المخزن المؤقت للعزل وخلايا الطرد المركزي عند 400 RCF لمدة 5 - 10 دقائق عند 4^درجاتمئوية.
8. شفط المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في عازلة عزل سعة 1 مل. ضع الخلايا على عمود مغناطيسي مغسول مسبقا. اغسل العمود مرتين باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت للعزل.
   1. قم بإزالة العمود من المغناطيس. الماصة 6 مل من المخزن المؤقت للعزل على العمود وطرد الخلايا المسماة مغناطيسيا في أنبوب تجميع معقم عن طريق دفع المكبس. خلايا الطرد المركزي عند 400 RCF لمدة 5 - 10 دقائق عند 4 ^درجاتمئوية.
   2. أعد تعليق الخلايا عند 100 ميكرولتر لكل 1 × 10⁷ خلايا وصمة عار بالأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور التالية: السلبية السلبية (TCRb و Siglec F و B220 و CD19 و FceRI و Ly6G) و MHCII و Ly-6C.
9. قم بفرز الخلايا عن طريق بوابات الخلايا الصغيرة ، باستخدام التشتت الجانبي (SSC) والتشتت الأمامي (FSC) ، والثقافة في وسط كامل مكمل ب 5 نانوغرام / مل لتر GM-CSF - احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 ^درجةمئوية للسماح للبلاعم بالالتصاق باللوحة. بعد ذلك ، انقل الخلايا السائبة وغير الملتصقة إلى طبق ثقافة جديد.
   ملاحظه: يتم تعريف MoDC للماوس على أنه CD11b ⁺ / CD11c ⁺ / MHCII^hi / Ly6C^{lo / int}. قد يختلف التعبير عن Ly6C بشكل كبير بين نماذج الورم ، وفي بعض النماذج (على سبيل المثال ، LMP) ، تفتقر MoDCs تماما إلى تعبير Ly6C. يحتوي ورم واحد 100 مم³ B16F10 عادة على 5 × 10⁴ من التيار المستمر ، مما ينتج عنه ما يقرب من 4-5 × 10⁶ خلايا إجمالية. من بين هذه الخلايا ، 10-15٪ خلايا مناعية و 8-10٪ من MoDC. يمكن تحقيق زيادة أعداد التيار المستمر عن طريق حقن الفئران بالأورام في مواقع متعددة. قم بفرز خلايا SSC / FCS الصغيرة فقط ، حيث يمكن للخلايا النخاعية الأخرى التعبير عن علامات مثل CD11c و Ly6C.
   اختياري: قم بفرز الخلايا الوحيدة المتسللة للورم كخلايا SSC / FSC صغيرة تعبر عن Ly6C^hi وتكون سالبة ل MHCII. بعد ذلك ، استزراع الخلايا الوحيدة في المختبر مع 50 نانوغرام / مل لتر GM-CSF للحصول على DC.

فئة < p = "jove_title" >2. تحضير المجمعات المناعية للورم IgG

1. زراعة الخلايا السرطانية في قارورة ثقافة 75 سم² إلى التقاء 70٪ في وسائط DMEM كاملة.
   1. أضف 2 مل من 0.25٪ تريبسين / EDTA لفصل الخلايا عن قارورة المزرعة ومراقبة مورفولوجيا الخلية تحت مجهر ضوئي لتجنب الإفراط في التربسين.
   2. أضف 8 مل من وسائط الثقافة الكاملة (لكل 2 مل من التربسين) لتثبيط هضم التربسين ، وأجهزة الطرد المركزي عند 4 ^درجاتمئوية ، 400 RCF لمدة 5-10 دقائق لحبيبات الخلايا.
      ملاحظه: افحص الخلايا السرطانية بحثا عن الميكوبلازما باستخدام مجموعة تفاعل البوليميراز المتسلسل التجارية. اختبار البكتيريا سالبة الجرام والسموم الداخلية الفطرية باستخدام مقايسة Limulus Amebocyte Lysate (LAL). يجب تصفية المصل من خلال 0.22 ميكرومتر واختباره بحثا عن الفيروسات 9 من مدونة اللوائح الفيدرالية. بالإضافة إلى ذلك ، اختبر وسائط الثقافة والأمصال عن طريق إسقاط 100 - 200 ميكرولتر على أجار LB أو المرق والثقافة لمدة يومين عند 37 ^درجةمئوية.
   3. اغسل الخلايا مرة أخرى من التربسين وبقايا المصل عن طريق إعادة تعليقها في 10 مل PBS وجهاز طرد مركزي عند 400 RCF لمدة 5 - 10 دقائق.
2. قم بإصلاح الخلايا في 1.8٪ بارافورمالدهيد مخزن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   1. اغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في 10 مل PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 4 ^درجاتمئوية 400 RCF لمدة 5 - 10 دقائق.
   2. استنشق المواد الطافية وكرر الغسيل مرتين أخريين.
      اختياري: بالنسبة لمقايسات امتصاص الورم ، يمكن تصنيف الخلايا عن طريق احتضانها لمدة 5 دقائق عند 37 ^درجةمئوية في PBS الذي يحتوي على 1 ميكرومتر كربوكسي فلورسين إستر السكسينيميديل (CFSE). ثم يتم إخماد CFSE بوسائط كاملة لمدة 10 دقائق في الثلج. يجب غسل الخلايا على نطاق واسع في PBS يحتوي على مصل 2٪ لإزالة الصبغة المتبقية.
3. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (PBS مكمل ب 2٪ FCS + 5 ملي مولار EDTA) و 0.5 ميكروغرام / مل من مضاد CD16 / 32 لمنع التفاعلات المحتملة غير المحددة بين البروتين والبروتين. صفيحة في شكل حرف U 96 بئرا / صفيحة بتركيز 1 × 10⁵ خلايا لكل 100 ميكرولتر.
   1. أضف تخفيفات مختلفة من الأجسام المضادة المرتبطة بالورم تتراوح من 5 ميكروغرام - 5 نانوغرام / 1 × 10⁵ خلايا. احتضن الطبق على الثلج لمدة 15-20 دقيقة
      ملاحظه: تم عزل الأجسام المضادة IgG من مصل إناث الفئران الساذجة التي تتراوح أعمارها بين 20 و 24 أسبوعا على أعمدة البروتين A ، كما هو موضح.
4. اغسل الخلايا بإضافة 150 ميكرولتر من PBS والطرد المركزي للوحة عند 4 ^درجاتمئوية 400 RCF لمدة 5 - 10 دقائق.
   1. تخلص من المواد الطافية وكرر الغسيل مرتين. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من FACS يحتوي على جسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروفور. احتضن الطبق على الثلج لمدة 20 دقيقة.
   2. اغسل الخلايا بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS والطرد المركزي للوحة عند 400 RCF لمدة 5 - 10 دقائق.
   3. تحليل ارتباط الورم عن طريق قياس التدفق الخلوي وتحديد الحد الأدنى من التركيز المطلوب لتغطية الخلايا. < / > ملاحظه: لا ينبغي استخدام الأجسام المضادة التي لا تزيد من متوسط شدة التألق (MFI) للخلايا السرطانية الملطخة بمقدار خمسة أضعاف على الأقل من التحكم في النمط المتماثل في المقايسات الوظيفية اللاحقة.

فئة

3. تنشيط MoDC باستخدام Tumor-IgG IC

1. قم بتغطية الخلايا السرطانية بتركيز IgG ضئيل، كما هو موضح في الأقسام من 2.1 إلى 2.4.3
   1. قبل يوم واحد من تنشيط MoDC باستخدام IC الورم ، استبدل وسائط زراعة MoDC التي تحتوي على GM-CSF. للقيام بذلك ، قم بشفط الوسائط برفق واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام وسائط مزرعة كاملة دافئة مسبقا.
      ملاحظه: يجب زراعة MoDC الناضجة المعزولة المرتبطة بالورم لمدة 2-3 ساعات على الأقل (أو حتى بين عشية وضحاها) بعد الفرز في وسائط كاملة بدون GM-CSF ، وقبل تنشيطها باستخدام IC.
   2. لتحليلات امتصاص الورم ، أضف IC الورم المسمى CFSE إلى MoDC بنسبة 1: 5 (IC: MoDC) واحتضانه طوال الليل لمدة 12 - 16 ساعة في 1 مل من الوسائط الكاملة لكل 1 × 10⁶ DC.
   3. بالنسبة لتحليلات FACS لتجارب تنشيط MoDC ، أضف الورم IC بنسبة 1: 1 (IC: MoDC) واحتضن بين عشية وضحاها لمدة 12 - 16 ساعة
      ملاحظه: يوصى بشدة بتضمين بئر تحكم إيجابي ، حيث يتم تحفيز MoDC ب 1 ميكروغرام / مل من LPS أو ناهضات TLR الأخرى.
   4. بعد التنشيط طوال الليل ، قم بشفط المواد الطافية وغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام عازل العزل أو 10 ملي متر EDTA HBSS.
   5. لفصل التيار المستمر عن اللوحة، قم باحتضان الخلايا لمدة 2-3 دقائق في 1 مل HBSS يحتوي على 10 ملي مولار EDTA وفصل الخلايا عن طريق سحب العينات القوية.
   6. خلايا الطرد المركزي عند 400 RCF وإعادة تعليق 1 × 10⁶ DC في 90 ميكرولتر PBS مكملة ب 2٪ FCS و 5 ملي مولار EDTA (المخزن المؤقت FACS) و 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة الحاظرة. احتضن على الجليد لمدة 5 - 10 دقائق.
   7. أضف 10 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الملطخة إلى الخلايا واحتضنه على الثلج لمدة 15 دقيقة.
   8. أضف 2 مل من المخزن المؤقت FACS إلى الخلايا وجهاز الطرد المركزي عند 4 ^درجاتمئوية 400 RCF لمدة 5 - 10 دقائق.
2. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر FACS المؤقت.
   1. أضف 0.5 - 1 ميكروغرام / مل من DAPI 1 - 2 دقيقة قبل تشغيل العينات لاستبعاد الخلايا الميتة من التحليلات. لا تفرط في احتضان DAPI ، حيث ستتناوله وزارة الدفاع في غضون 10 - 15 دقيقة.

Materials