Method Article

الكشف عن بروتينات البريون غير الطبيعية في أنسجة المخ باستخدام الكيمياء المناعية

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Orge، L.، et al. الكشف عن بروتين البريون غير الطبيعي عن طريق الكيمياء المناعية. J. Vis. Exp. (2023).

يوضح هذا الفيديو تقنية للكشف عن بروتين البريون غير المطوي في أقسام الدماغ باستخدام الكيمياء المناعية. عند معالجة قسم الدماغ بحمض الفورميك لتغيير طبيعة البريونات وتقليل مخاطر العدوى ، بالإضافة إلى الكشف عن مجاميع البريون باستخدام استرجاع الحاتمة الناجم عن الحرارة ، يتم تصنيف الأقسام مناعية لمجاميع بروتين البريون غير المطوية وملاحظتها تحت المجهر.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. تقسيم الأنسجة وإعداد الشرائح

  1. قطع أجزاء من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين (FFPE) بسمك 3-5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
  2. قم بتعويم الأقسام على الماء النقي بدرجة حرارة أقل بحوالي 10 درجات مئوية من نقطة انصهار البارافين المستخدم. ارفع الأقسام من الماء على شرائح مجهر معالجة خصيصا (انظر جدول المواد). اترك الماء يجف تماما من الشرائح.
  3. احتضان الشرائح طوال الليل عند 50 درجة مئوية لتعزيز التصاق الشرائح للأنسجة.
    ملاحظه: يفضل تحضير الأنسجة المقطعة حديثا لبروتوكولات IHC ، على الرغم من أنه يمكن تحضير أقسام التحكم الإيجابية والسلبية مسبقا وتخزينها. يجب تنفيذ الخطوات من 2 إل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments الإيثانول المطلق لابكيم LB0507-9010 مخفف                مخفف بنسبة 90٪ و 70٪ و 50٪ في الماء المقطر مركب أفيدين بيوتين وبيروكسيداز
مجموعة Vectastain Elite ABC بيروكسيداز مختبرات ناقلات PK-6100 قم بالتحضير والخلط برفق قبل 30 دقيقة من الاستخدام وفقا لتعليمات المجموعة. لا تخلط بعد الوقوف. الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل (Horse المضاد للفأر IgG H + L) مختبرات ناقلات بكالوريوس 2000-1.5 خفف بمعدل 1/200 في TBS مع مصل عادي للحصان بنسبة 10٪. قم بإعداد الحجم المطلوب حسب عدد الأقسام. كروموجين ديامينوبنزيدين- DAB ، طقم الركيزة ، بيروكسيداز مختبرات ناقلات سك 4100 تحضير قبل الاستخدام وفقا لتعليمات المجموعة.
استخدم 400 ميكرولتر من المحلول لكل قسم. غرفة ضغط DakoCytomation Pascal داكو S2800 هيماتوكسيلين إيرليش: الإيثانول المطلق لابكيم LB0507-9010 حمض الخليك الجليدي ميرك هاتف: 101830 شب البوتاسيوم ميرك 1.01047.1000 الجليسرين ميرك 1.04091.1000 محلول كتلة البيروكسيديز الذاتي (تركيز 3٪ H2O2): 40 مل بيروكسيد الهيدروجين (30٪ وزن / وزن) في 360 مل من الميثانول.
تحضير قبل الاستخدام بيروكسيد الهيدروجين (30٪ وزن / وزن) شارلاو مرحاء0136 ميثانول سيجما ألدريتش 322415-2 لتر حمض الفورميك 98٪ ميرك 1.00264.1000 مخفف ميكروتوم شاندون-AS325 ميكروتوم شاندون-AS325 محلول كتلة المصل العادي (20٪) في TBS:
مصل الحصان العادي جيبكو 16050-122 قم بإعداد المجلد النهائي وفقا لعدد الأقسام في المقايسة
(200 ميكرولتر من المحلول لكل قسم). الأجسام المضادة الأولية المضادة لمادة PRP Mouse MAb 2G11 بيوراد MCA2460 PRP 146-R154R171182
الغناء بما في ذلك سكروبي غير نمطي ، عنق الرحم ، القطط. غير مناسب للأبقار.
وفقا لعدد الأقسام في الفحص (200 ميكرولتر من المحلول لكل قسم) وتخفيف الأجسام المضادة ، قم بإعداد الحجم النهائي في TBS مع استكمال 10٪ من المصل الطبيعي من الأنواع التي تم رفع الجسم المضاد الثانوي في (مصل الحصان العادي)
التخفيف المعتاد للأجسام المضادة: MAb 2G11 1/100 ولكن يجب إنشاء تخفيف العمل في كل دفعة جديدة للحصول على التركيز لإعطاء أقوى ملصقات بأقل خلفية. للتخزين ، قم بتجميد أحجام الكميات التي لا تقل عن 10 ميكرولتر في أنابيب دقيقة معقمة. قم بإذابة الثلج واستخدام حصة واحدة في كل مرة. الأجسام المضادة الأولية المضادة لمادة PRP الفأر MAb 12F10 شركة كايمان للكيماويات 189710 PrP142-160
بقري ، غير مناسب للأغنام
التخفيف المعتاد للأجسام المضادة: 1/200 ولكن يجب أيضا إنشاء تخفيف العمل. التحضير ك MAb 2G11 غرفة Shandon CoverplateTM الترمو: العلمية 72110017 مركز شاندون سيكوينزا® للمناعة الترمو: العلمية 73300001 شاندون Sequenza® تحصين رف الشرائح الترمو: العلمية 73310017 محلول السترات المخزن المؤقت (10 ملي مولار الرقم الهيدروجيني 6.1): 2.55 جم ثلاثي سترات الصوديوم ثنائي هيدرات و 0.255 جم حامض الستريك في لتر واحد من الماء النقي.
اضبط درجة الحموضة لمحلول العمل على 6.1 باستخدام محلول حامض الستريك 10 ملي مولار (1.05 جم حامض الستريك في 500 مل من الماء النقي)
استعد في يوم الفحص. ثلاثي سترات الصوديوم ثنائي هيدرات سيجما ألدريتش S4641-500G حامض الستريك سيجما ألدريتش ج0759 جرة تلطيخ وسلة دلطالب 19360 19361 شرائح مجهر Superfrost Plus VWR 631-0108 محلول ملحي مخزن ثلاثي (TBS) (50 ملي متر من قاعدة تريزما؛ 0.8٪ NaCI؛ الرقم الهيدروجيني 7.6): 10xTBS (محلول مخزون 0.5 م قاعدة TRIZMA ؛ 8٪ NaCI ؛ درجة الحموضة 7.6):
قاعدة TRIZMA 60,57 جم و كلوريد الصوديوم 80 جم في 800 مل من الماء النقي. اضبط درجة الحموضة لمحلول المرق باستخدام حمض الهيدروكلوريك 37٪ والحجم النهائي إلى لتر واحد بالماء النقي (احتفظ ب 5± 3 درجات مئوية حتى شهرين)
تمييع محلول مخزون TBS 1/10 في يوم الفحص. قاعدة تريزما سيجما ألدريتش تي 6066-1 كجم كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ميرك 106404 الزيلين كواشف Panreac Applied Chem ITW 251769 مخفف

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Prion Protein DetectionImmunohistochemistryFormic Acid TreatmentHeat Induced Epitope RetrievalEndogenous Peroxidase InactivationPrimary Antibody BindingBiotinylated Secondary AntibodyAvidin Biotin ComplexChromogenic SubstrateMicroscopic Observation

Related Articles