Method Article

الكشف عن بروتينات البريون غير الطبيعية في أنسجة المخ باستخدام الكيمياء المناعية

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Orge، L.، et al. الكشف عن بروتين البريون غير الطبيعي عن طريق الكيمياء المناعية. J. Vis. Exp. (2023).

يوضح هذا الفيديو تقنية للكشف عن بروتين البريون غير المطوي في أقسام الدماغ باستخدام الكيمياء المناعية. عند معالجة قسم الدماغ بحمض الفورميك لتغيير طبيعة البريونات وتقليل مخاطر العدوى ، بالإضافة إلى الكشف عن مجاميع البريون باستخدام استرجاع الحاتمة الناجم عن الحرارة ، يتم تصنيف الأقسام مناعية لمجاميع بروتين البريون غير المطوية وملاحظتها تحت المجهر.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. تقسيم الأنسجة وإعداد الشرائح

  1. قطع أجزاء من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين (FFPE) بسمك 3-5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
  2. قم بتعويم الأقسام على الماء النقي بدرجة حرارة أقل بحوالي 10 درجات مئوية من نقطة انصهار البارافين المستخدم. ارفع الأقسام من الماء على شرائح مجهر معالجة خصيصا (انظر جدول المواد). اترك الماء يجف تماما من الشرائح.
  3. احتضان الشرائح طوال الليل عند 50 درجة مئوية لتعزيز التصاق الشرائح للأنسجة.
    ملاحظه: يفضل تحضير الأنسجة المقطعة حديثا لبروتوكولات IHC ، على الرغم من أنه يمكن تحضير أقسام التحكم الإيجابية والسلبية مسبقا وتخزينها. يجب تنفيذ الخطوات من 2 إلى 4 في غطاء دخان كيميائي.
< p class = "jove_title" >2. إزالة البارافين وإعادة الجفاف

  1. ضع الشرائح مع أقسام المناديل في سلة تلطيخ من الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر جدول المواد). اغمر السلة في حمام الزيلين (حاوية تلطيخ من الفولاذ المقاوم للصدأ) لمدة 3 دقائق ، ثم أخرجها واغمرها مرة أخرى.
  2. قم بإزالة الزيلين وإعادة ترطيب الأقسام عن طريق غمرها في حمام الإيثانول المطلق لمدة 3 دقائق.
  3. جفف الأقسام في الهواء وضعها في حمام الإيثانول بنسبة 90٪ لمدة دقيقة واحدة. انقله إلى حمام الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة دقيقة أخرى ، متبوعا بنقل نهائي إلى حمام الإيثانول بنسبة 50٪ لمدة دقيقة واحدة. لكل علاج لحمام الإيثانول ، حرك سلة الانزلاق برفق مرتين وصفي السلة قبل النقل التالي.
< p class = "jove_title" >3. استرجاع الحاتمة

  1. اغمر أقسام المناديل بعناية في 98٪ حمض الفورميك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اشطف الأقسام بماء الصنبور لمدة 5 دقائق ، متبوعا بالشطف مرتين في الماء المقطر.
    أنذر: حمض الفورميك شديد التآكل. يجب ارتداء النظارات الواقية والقفازات.
  2. قم بإجراء استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة (HIER) باتباع الخطوات أدناه.
    ملاحظه: يتم تنفيذ هذه الخطوة عن طريق التعقيم المائي عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في غرفة ضغط محددة (انظر جدول المواد).
    1. قم بتسخين مخزن السترات المؤقت مسبقا (10 ملي مولار ، درجة الحموضة 6.1 ، انظر جدول المواد) عند 98 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا في وعاء تلطيخ من الفولاذ المقاوم للصدأ يوضع داخل غرفة الضغط مملوءة ب 500 مل من الماء المقطر><. ملاحظه: بالنسبة للدراسة الحالية ، كانت نقطة ضبط البرنامج هي 1 (SP1) للمعدات المحددة المستخدمة.
    2. بعد أن يشير الإنذار إلى أن الجهاز قد وصل إلى الوقت ودرجة الحرارة المبرمجين ، اغمر السلة بالشرائح وابدأ البرنامج على ضبط النقطة 2 (121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة). لأغراض مراقبة الجودة ، ضع قسما من شريط مؤشر الأوتوكلاف اللاصق على السلة لمراقبة درجة الحرارة والضغط ، وسجل الضغط الأولي والنهائي لهذا البرنامج.
      3. إذا لم يصل
    3. عدد الشرائح المراد تلطيخها إلى سعة السلة ، فاستخدم شرائح نظيفة وفارغة لشغل أي مواضع فارغة. بعد انتهاء البرنامج ، اسمح بالعودة السلبية للغرفة إلى الضغط المحيط (30 دقيقة على الأقل).
      ملاحظه: قد تقلل الفترات الأطول من تلطيخ الخلفية غير المحدد.
    4. انقل سلة الشرائح بعناية إلى وعاء تلطيخ من الفولاذ المقاوم للصدأ مملوء بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
< p class = "jove_title" >4. تعطيل البيروكسيديز الداخلي

  1. اغمر سلة الشرائح التي تحتوي على أقسام العينة في حمام من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ (H2O2) في الميثانول لمدة 30 دقيقة. اشطف الأقسام تحت الماء الجاري (5 دقائق). صفي الأقسام واغمريها في محلول ملحي مخزن بمقدار 1 × تريس (TBS) لمدة 5 دقائق إضافية.
< p class = "jove_title" >5. الكشف عن المناعة

ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم تنفيذ الكشف المناعي باستخدام تنسيق الفجوة الشعرية باستخدام نظام تجميع مشبك الشرائح المتاح تجاريا (انظر جدول المواد). أنظمة شرائح الكيمياء المناعية الأخرى قابلة للتطبيق أيضا.

  1. ضع كل شريحة على حامل لوحة الغطاء المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) مبلل مسبقا باستخدام TBS ، مع تجنب الفقاعات ، بحيث يكون جانب الأنسجة مواجها للحامل وحواف الشريحة تتزامن مع النقطتين السفليتين للحامل.
    1. أمسك مجموعة حامل الشريحة بين الإبهام والسبابة ، بإصبع واحد أعلى شريحة العينة والآخر في الجزء السفلي من الحامل. ثم ضع التجميع في معرض النظام.
    2. لضمان تجميع المجموعة جيدا ، املأ البئر بين شريحة العينة والحامل ب TBS ، والذي يجب ألا يفيض على الفور. من هذه النقطة فصاعدا ، تأكد من الاحتفاظ بحوالي 80 ميكرولتر من TBS بين الحامل والشريحة. لا تدع الأقسام تجف.
  2. بمجرد دخولك إلى النظام ، لتقليل تلطيخ الخلفية قبل العلاج بالجسم المضاد الأولي (الجسم المضاد ضد بروتينات البريون (المضاد للبلازما الغنية بالصفائح الدموية) ، انظر جدول المواد) ، قم باحتضان شرائح العينة مسبقا مع مصل طبيعي بنسبة 20٪ من نفس النوع مثل مضيف الجسم المضاد الثانوي الذي يتم استخدامه للتلوين المناعي (في الحالة الحالية ، مصل الحصان) لمدة 30 دقيقة في TBS.
  3. قم بإذابة عدد حصص الجسم المضاد المراد استخدامها وفقا للأنواع الحيوانية قيد التحليل ، وعدد أقسام العينة المراد فحصها ، ومقدار التخفيف العامل.
    ملاحظه: للحصول على أفضل النتائج ، استخدم مصل طبيعي بنسبة 10٪ من نفس النوع كمصدر للأجسام المضادة الثانوية ومحاليل الأجسام المضادة الأولية. إذا كان ذلك ممكنا ، للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن يكون المصدر المضيف للمصل الطبيعي والجسم المضاد الثانوي من نفس النوع.
  4. دون غسل الأقسام ، ضع محلول الجسم المضاد الأساسي مباشرة (200 ميكرولتر) في كل بئر من مجموعة حامل الشريحة واحتضانه لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. للغسيل ، املأ آبار مجموعات حامل الشرائح ب TBS وانتظر لمدة 5 دقائق. كرر مرتين.
  6. تمييع الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل (أحادي النسيلة المضاد للفئران Horse Ab ، انظر جدول المواد) عند 1/200 في TBS مع مصل الحصان بنسبة 10٪. قم بإعداد الحجم المطلوب حسب عدد الأقسام المراد معالجتها.
  7. ضع محلول الأجسام المضادة الثانوية (200 ميكرولتر) على كل بئر من مجموعة حامل الشرائح. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. اغسل كما هو موضح في الخطوة 5.5.
  9. للحضانة مع مركب أفيدين-بيوتين بيروكسيداز (مركب ABC/HRP، انظر جدول المواد)، قم بإعداد الكاشف قبل 30 دقيقة من الاستخدام. قم بتطبيق المحلول المركب ABC / HRP (200 ميكرولتر) في كل بئر من مجموعة حاملات الألواح المنزلقة. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. اغسل كما هو موضح في الخطوة 5.5.
فئة < ص = "jove_title" >6. التطوير باستخدام كروموجين 3،3 'ديامينوبنزيدين (DAB)

تنبيه: DAB مادة مسرطنة محتملة. نتيجة لذلك ، من الضروري الرعاية المناسبة أثناء العمل مع هذا الكاشف ، بما في ذلك حماية العين ومعاطف المختبر والقفازات والإجراءات المعملية الجيدة. تخلص من اتباع اللوائح المحلية.

  1. قم بتخفيف الكروموجين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) مباشرة قبل الاستخدام. ضع محلول الكروموجين (400 ميكرولتر) على كل بئر من مجموعة الألواح المنزلقة.
  2. احتضن لمدة تصل إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في الأقسام الإيجابية ل PrPSc (الشكل الإسوي غير الطبيعي لبروتينات البريون) ، عادة ما تكون فترة الحضانة لمدة 10 دقائق كافية.
  3. قم بإزالة محلول الكروموجين المتبقي عن طريق غسل الشرائح بالماء المقطر. قم بإزالة الشرائح من حاملات الغطاء وضعها في وعاء بلاستيكي به ماء مقطر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments الإيثانول المطلق لابكيم LB0507-9010 مخفف                مخفف بنسبة 90٪ و 70٪ و 50٪ في الماء المقطر مركب أفيدين بيوتين وبيروكسيداز
مجموعة Vectastain Elite ABC بيروكسيداز مختبرات ناقلات PK-6100 قم بالتحضير والخلط برفق قبل 30 دقيقة من الاستخدام وفقا لتعليمات المجموعة. لا تخلط بعد الوقوف. الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل (Horse المضاد للفأر IgG H + L) مختبرات ناقلات بكالوريوس 2000-1.5 خفف بمعدل 1/200 في TBS مع مصل عادي للحصان بنسبة 10٪. قم بإعداد الحجم المطلوب حسب عدد الأقسام. كروموجين ديامينوبنزيدين- DAB ، طقم الركيزة ، بيروكسيداز مختبرات ناقلات سك 4100 تحضير قبل الاستخدام وفقا لتعليمات المجموعة.
استخدم 400 ميكرولتر من المحلول لكل قسم. غرفة ضغط DakoCytomation Pascal داكو S2800 هيماتوكسيلين إيرليش: الإيثانول المطلق لابكيم LB0507-9010 حمض الخليك الجليدي ميرك هاتف: 101830 شب البوتاسيوم ميرك 1.01047.1000 الجليسرين ميرك 1.04091.1000 محلول كتلة البيروكسيديز الذاتي (تركيز 3٪ H2O2): 40 مل بيروكسيد الهيدروجين (30٪ وزن / وزن) في 360 مل من الميثانول.
تحضير قبل الاستخدام بيروكسيد الهيدروجين (30٪ وزن / وزن) شارلاو مرحاء0136 ميثانول سيجما ألدريتش 322415-2 لتر حمض الفورميك 98٪ ميرك 1.00264.1000 مخفف ميكروتوم شاندون-AS325 ميكروتوم شاندون-AS325 محلول كتلة المصل العادي (20٪) في TBS:
مصل الحصان العادي جيبكو 16050-122 قم بإعداد المجلد النهائي وفقا لعدد الأقسام في المقايسة
(200 ميكرولتر من المحلول لكل قسم). الأجسام المضادة الأولية المضادة لمادة PRP Mouse MAb 2G11 بيوراد MCA2460 PRP 146-R154R171182
الغناء بما في ذلك سكروبي غير نمطي ، عنق الرحم ، القطط. غير مناسب للأبقار.
وفقا لعدد الأقسام في الفحص (200 ميكرولتر من المحلول لكل قسم) وتخفيف الأجسام المضادة ، قم بإعداد الحجم النهائي في TBS مع استكمال 10٪ من المصل الطبيعي من الأنواع التي تم رفع الجسم المضاد الثانوي في (مصل الحصان العادي)
التخفيف المعتاد للأجسام المضادة: MAb 2G11 1/100 ولكن يجب إنشاء تخفيف العمل في كل دفعة جديدة للحصول على التركيز لإعطاء أقوى ملصقات بأقل خلفية. للتخزين ، قم بتجميد أحجام الكميات التي لا تقل عن 10 ميكرولتر في أنابيب دقيقة معقمة. قم بإذابة الثلج واستخدام حصة واحدة في كل مرة. الأجسام المضادة الأولية المضادة لمادة PRP الفأر MAb 12F10 شركة كايمان للكيماويات 189710 PrP142-160
بقري ، غير مناسب للأغنام
التخفيف المعتاد للأجسام المضادة: 1/200 ولكن يجب أيضا إنشاء تخفيف العمل. التحضير ك MAb 2G11 غرفة Shandon CoverplateTM الترمو: العلمية 72110017 مركز شاندون سيكوينزا® للمناعة الترمو: العلمية 73300001 شاندون Sequenza® تحصين رف الشرائح الترمو: العلمية 73310017 محلول السترات المخزن المؤقت (10 ملي مولار الرقم الهيدروجيني 6.1): 2.55 جم ثلاثي سترات الصوديوم ثنائي هيدرات و 0.255 جم حامض الستريك في لتر واحد من الماء النقي.
اضبط درجة الحموضة لمحلول العمل على 6.1 باستخدام محلول حامض الستريك 10 ملي مولار (1.05 جم حامض الستريك في 500 مل من الماء النقي)
استعد في يوم الفحص. ثلاثي سترات الصوديوم ثنائي هيدرات سيجما ألدريتش S4641-500G حامض الستريك سيجما ألدريتش ج0759 جرة تلطيخ وسلة دلطالب 19360 19361 شرائح مجهر Superfrost Plus VWR 631-0108 محلول ملحي مخزن ثلاثي (TBS) (50 ملي متر من قاعدة تريزما؛ 0.8٪ NaCI؛ الرقم الهيدروجيني 7.6): 10xTBS (محلول مخزون 0.5 م قاعدة TRIZMA ؛ 8٪ NaCI ؛ درجة الحموضة 7.6):
قاعدة TRIZMA 60,57 جم و كلوريد الصوديوم 80 جم في 800 مل من الماء النقي. اضبط درجة الحموضة لمحلول المرق باستخدام حمض الهيدروكلوريك 37٪ والحجم النهائي إلى لتر واحد بالماء النقي (احتفظ ب 5± 3 درجات مئوية حتى شهرين)
تمييع محلول مخزون TBS 1/10 في يوم الفحص. قاعدة تريزما سيجما ألدريتش تي 6066-1 كجم كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ميرك 106404 الزيلين كواشف Panreac Applied Chem ITW 251769 مخفف

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Prion Protein DetectionImmunohistochemistryFormic Acid TreatmentHeat Induced Epitope RetrievalEndogenous Peroxidase InactivationPrimary Antibody BindingBiotinylated Secondary AntibodyAvidin Biotin ComplexChromogenic SubstrateMicroscopic Observation

Related Articles