تقنية للكشف عن سلالات البكتيريا الزرقاء باستخدام شريحة مصفوفة دقيقة للأجسام المضادة

الملخص

المصدر: Blanco، Y. et al. ، بروتوكول تجريبي للكشف عن البكتيريا الزرقاء في العينات السائلة والصلبة باستخدام رقاقة مصفوفة دقيقة للأجسام المضادة.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو طريقة للكشف عن سلالات البكتيريا الزرقاء في عينة بيئية باستخدام شريحة مصفوفة دقيقة للأجسام المضادة. تتفاعل العينات التي تحمل بكتيريا مختلفة مع الأجسام المضادة المطبوعة ، ويكشف التلوين المناعي مع الأجسام المضادة للسلالة الزرقاء المسمى بالفلوروفور عن وجود سلالات معينة من البكتيريا الزرقاء من خلال التألق في أماكن مميزة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الوكيدات المناعية

1. قم بزراعة كل سلالة من البكتيريا الزرقاء في وسط الاستزراع المقابل في ظل الظروف الموضحة في الجدول 1. < / > ملاحظة: وسط النمو وظروف الثقافة لكل سلالة من سلالات البكتيريا الزرقاء مذكورة في الجدول 1. تنتمي جميع سلالات البكتيريا الزرقاء ، باستثناء K17 ، إلى مجموعة أنطونيو كيسادا من جامعة أوتونوما (مدريد ، إسبانيا). تم إنشاء الجسم المضاد ضد العوالق rubescens من عينة طبيعية من الإزهار أحادي النوع لهذه البكتيريا الزرقاء من خزان Vilasouto (شمال إسبانيا).
2. حدد عدد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا عن طريق الفحص المجهري البصري للحصول على ما يقرب من 10⁸ خلايا / مل من ثقافة مرحلة النمو الأسي أو الثابتة المتأخرة.
3. حصاد الخلايا من 5 مل من المزرعة عن طريق الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق.
4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في أنبوب سعة 10 مل مع 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (1x PBS) للحصول على حوالي 10⁸ خلايا / مل.
5. تجانس وتحلل خلايا التعليق عن طريق الصوتنة لمدة 5 دورات ، 30 ثانية لكل منها ، مع توقف مؤقت من 30 إلى 60 ثانية على الجليد ، باستخدام معالج بالموجات فوق الصوتية المحمول باليد أو عن طريق غمس الأنبوب في الحمام المائي لاضطراب الخلية بأقصى سعة (30 كيلو هرتز).
6. كرر الخطوات 1.3 - 1.5 لكل سلالة من البكتيريا الزرقاء. < / > ملاحظة: ينتج عن صوتنة اضطراب الخلية وإطلاق المحتوى الخلوي. في حين أن البروتينات والسكريات هي عناصر مناعية جيدة ، إلا أن جزيئات معينة ، مثل الدهون والأحماض النووية ، لا تحفز استجابة مناعية خلطية من تلقاء نفسها. لذلك ، يجب أن ترتبط بالناقلات ، مثل السكريات أو البروتينات ، لزيادة التعقيد الجزيئي. بالإضافة إلى ذلك ، تطلق الصوتنة مادة داخل الخلايا يمكن أن تؤدي إلى إنتاج الأجسام المضادة.

< p class = "jove_title" >2. إنتاج الأجسام المضادة متعددة النسيلة

1. قم بإعداد الجرعة المناعية الأولى عن طريق خلط 0.5 مل من محللة الخلايا بالموجات فوق الصوتية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.5 مع 0.5 مل من مساعد فرويند الكامل. قم بتسليمه إلى مشغل منشأة حيوانية لإنتاج الأجسام المضادة للأرانب متعددة النسيلة.
2. قم بإعداد ثلاث جرعات أخرى كما كان من قبل لاستخدامها مرة أخرى كتعزيز للذاكرة في عملية إنتاج الأجسام المضادة عن طريق خلط 0.5 مل من نفس المتجانس / المحلل الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.5 مع 0.5 مل من مساعد فرويند غير المكتمل. أعطها للمنشأة الحيوانية لإنجاز عملية إنتاج الأجسام المضادة.
3. كرر الخطوتين 2.1 و 2.2 لكل عملية إنتاج أجسام مضادة جديدة. < / > ملاحظة: عادة ما يعهد بإنتاج الأجسام المضادة إلى مرافق أو شركات حيوانية متخصصة لأن الترخيص والتدريب المناسبين مطلوبان للعمل مع. توفر الشركات قياسا نسبيا لمقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لكمية الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد الموجودة في عينة المصل.

فئة

3. تنقية الأجسام المضادة

1. قم بتنقية جزء الغلوبولين المناعي G (IgG) من كل من المصل المناعي ومصل ما قبل المناعة الذي تم جمعه في الخطوة 2 بواسطة كروماتوغرافيا تقارب البروتين A. تعمل بعض مجموعات التنقية التجارية ، القائمة على أنظمة الخرطوشة ، بشكل جيد. اتبع تعليمات المزود.
2. عندما لا توفر مجموعة التنقية نظام تحلية المياه ، قم بتغيير المخزن المؤقت بعد شطف الأجسام المضادة المنقاة إلى 0.1x PBS ، إما عن طريق غسيل الكلى أو باستخدام أجهزة تصفية الطرد المركزي بحجم مسام غشاء 100 كيلو دالتون (أو أقل).
3. حدد تركيز الجسم المضاد عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر أو باستخدام طرق قياس الألوان ، مثل برادفورد أو لوري أو حمض البيسنشونينيك (BCA).
   ملاحظة: من المهم تجنب تضمين مجموعات الأمين في مخزن الشطف (على سبيل المثال ، مخازن Tris) لأنها تتنافس مع الجسم المضاد للارتباط بالأسطح الصلبة المنشطة بمجموعات الإيبوكسي. بعد التنقية ، من المهم اختبار نشاط الجسم المضاد باستخدام ELISA.

فئة

4. وضع العلامات على الأجسام المضادة الفلورية

1. قم بتسمية الأجسام المضادة المنقاة التي تم الحصول عليها في القسم 3 باستخدام فلوروكروم (على سبيل المثال ، صبغة فلورية حمراء بعيدة) عن طريق إذابة قارورة تجارية تحتوي على صبغة لوضع العلامات على 1 مجم من البروتين في 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). أضف 2 ميكرولتر من الصبغة المذابة إلى كل مستحضر للأجسام المضادة بتركيز 2 مجم / مل في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 50 ملي مولار (درجة الحموضة 8.5).
2. حافظ على تفاعلات الملصقات تحت التحريض المستمر لمدة ساعة واحدة في درجة الحرارة المحيطة و 1,200 دورة في الدقيقة على منصة اهتزازية.
قم
3. بتنقية الأجسام المضادة المصنفة حسب كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (على سبيل المثال ، باستخدام هلام بنطاق تجزئة يتراوح بين 1.5 و 30 كيلو دالتون محاصر في عمود) ، باتباع توصيات الموردين.
4. قم بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر وعند 650 نانومتر في المصفاة وحساب كفاءات الملصقات باتباع توصيات الموردين.
   ملاحظة: يمكن إجراء ما يصل إلى 50 × 50 ميكرولتر من تفاعلات وضع العلامات على الأجسام المضادة باستخدام قارورة واحدة من صبغة الفلورسنت لوضع العلامات على 1 مجم من البروتين. يوصى بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم أو ، بدلا من ذلك ، استخدام أنابيب غير شفافة سعة 0.5 مل لتجنب عمليات التبريد بعد الخطوة 4.3. بالنسبة للأجسام المضادة IgG ، يتم تحقيق الملصقات المثلى ب 3-7 مول من الصبغة لكل مول من الجسم المضاد.

فئة

5. إنتاج CYANOCHIP

1. الأجسام المضادة والضوابط في محلول الطباعة
   1. قم بإعداد 30 ميكرولتر من كل جسم مضاد منقى في محلول الطباعة عن طريق خلط كل جسم مضاد بمعدل 1 مجم / مل في مخزن مؤقت تجاري لطباعة البروتين 1x مع 0.01٪ (حجم / حجم) Tween 20 (منظف غير أيوني) ، كل ذلك كتركيزات نهائية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، قد يحتوي محلول الأجسام المضادة على 20٪ جلسرين ، و 1٪ (وزن / حجم) سكروز (أو تريهالوز ، كمادة حافظة) ، و 0.01٪ (حجم / حجم) توين 20 في محلول كربونات (درجة الحموضة 8.5).
   2. قم بإعداد 30 ميكرولتر من محلول الطباعة كعناصر تحكم: (أ) 1x مخزن مؤقت لطباعة البروتين مع 0.01٪ (حجم / حجم) Tween 20 ، (ب) مصل بروتين - A منقى قبل المناعة عند 1 مجم / مل في 1x مخزن مؤقت لطباعة البروتين مع 0.01٪ (حجم / حجم) Tween 20 ، و (ج) ألبومين مصل الأبقار (BSA) عند 1 مجم / مل في 1x مخزن مؤقت لطباعة البروتين مع 0.01٪ (حجم / حجم) Tween 20.
   3. قم بإعداد 30 ميكرولتر من مصل ما قبل المناعة المنقى المسمى بالفلورسنت بتركيزات مختلفة (على سبيل المثال ، من 50 ميكروغرام / مل إلى 1 ميكروغرام / مل) في 1x مخزن مؤقت لطباعة البروتين مع Tween 20 ، كما في الخطوة 5.1.1. سيتم استخدام هذه العينات كعلامات إطار فلورية ولقياس كمية التألق النسبي بعد الإكتشاف.
   4. أضف 30 ميكرولتر لكل بئر من محاليل الطباعة المعدة في الخطوات 5.1.1 و 5.1.2 و 5.1.3 إلى الألواح الدقيقة ذات 384 بئرا الأعلى جودة لتصنيع المصفوفات الدقيقة ، مثل البولي بروبلين. < / > ملاحظة: يزيد المخزن المؤقت لطباعة البروتين من جودة واستقرار الأجسام المضادة ، ويقوم Tween 20 بتجانس مورفولوجيا البقع ويبني اقتران البروتين. يوصى بالحفاظ على الصفيحة الدقيقة 384 بئر عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. قم بتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن. يحتوي البولي بروبلين على انخفاض الحمض النووي والبروتين ومستخلص الخلايا والارتباط الجوهري للجزيء الصغير.
2. طباعة الأجسام المضادة على شريحة المجهر
   ملاحظة: اطبع الأجسام المضادة على شرائح المجهر المنشط باستخدام منصات مصفوفة مختلفة ، مثل أجهزة التلامس أو الإبرة المنقسمة أو غير الملامسة ، مثل الطابعات الكهروإجهادية أو تقنيات "نفث الحبر". في هذا العمل ، تمت طباعة CYANOCHIP بشكل روتيني عن طريق الاتصال باستخدام نظام آلي (مصفوفة) قادر على اكتشاف كميات nL من الأجسام المضادة على مقياس ميكرومتر.
   1. اضبط الظروف البيئية لغرفة الطباعة على 20 درجة مئوية ورطوبة نسبية 40-50٪.
   2. قم بإعداد ركائز الشرائح (على سبيل المثال ، شرائح زجاجية مجهرية منشطة بالإيبوكسي مقاس 75 × 25 مم) لأداء العديد من مصفوفات الأجسام المضادة المتطابقة في كل شريحة.
   3. حدد كل جسم مضاد منقى ، بما في ذلك عناصر التحكم والإطار المرجعي ، في نمط بقعة ثلاثي النسخ ؛ في ظل هذه الظروف ، يبلغ قطر البقع 180-200 ميكرومتر.
   4. بعد الطباعة ، اترك الشرائح لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة الحرارة المحيطة للسماح لها بالجفاف ، ثم قم بتخزينها عند 4 درجات مئوية ؛ للعمل في الميدان ، يمكن نقل الشرائح وتخزينها في درجة الحرارة المحيطة لعدة ><أشهر. ملاحظة: تتم طباعة CYANOCHIP بتنسيق صفيف دقيق موضعي ثلاثي النسخ مع 3 × 8 مصفوفات دقيقة متطابقة لكل شريحة أو 9 صفوفات متطابقة بتنسيق مصفوفة دقيقة 1 × 9. يجب ألا يكون حجم كل مصفوفة أعلى من أبعاد غرفة التفاعل لحشية 24 بئرا (عادة 7.5 × 6.5 مم في غرفة تهجين 3 × 8).
   5. قبل استخدام المصفوفة الدقيقة لتحليل العينات البيئية، استخدم المقايسة المناعية للمصفوفة الدقيقة لساندويتشات الفلورسنت (FSMI) لتحديد التخفيف الوظيفي لكل جسم مضاد في منحنى المعايرة بالتحليل الحجمي. لكل جسم مضاد ، استخدم تركيزا قياسيا للجين المناعي المقابل (10³ - 10⁴ خلايا / مل) والتخفيفات التسلسلية للجسم المضاد الفلوري (بين 1: 500 و 1: 32،000). يتوافق تركيز الجسم المضاد الأمثل مع 50٪ من الحد الأقصى لشدة الإشارة التي تم الحصول عليها في منحنى المعايرة بالتحليل الحجمي. أيضا ، يجب تحديد حساسية وخصوصية كل جسم مضاد ، كما هو موضح في بلانكو وآخرون.

فئة

6. تحضير مستخلصات التحليل البيئي متعدد التحليلات للمقايسة المناعية الدقيقة لساندويتش الفلورسنت (FSMI)

1. مستخلص Multianalyte من عينة سائلة
   1. خذ 1 - 100 مل من العينة السائلة باستخدام حقنة معقمة (على سبيل المثال ، الماء من شاطئ خزان المياه) ؛ تعتمد كمية العينة بشكل كبير على التركيز المحتمل للأهداف.
   2. تركيز الخلايا عن طريق تمرير عينة الماء من خلال فلتر بولي كربونات بحجم 3 ميكرومتر وقطر 47 مم ؛ من المستحسن التركيز الخلوي بين 10³ - 10⁸ خلايا / مل للكشف الإيجابي ، لكن التركيز الفعلي غير معروف.
   3. استرجع الكتلة الحيوية التي تم جمعها في المرشح باستخدام 1 مل من محلول ملحي معدل مخزنة من Tris ، ومخزن مؤقت مقوى ب Tween 20 (TBSTRR ؛ 0.4 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8) ، 0.3 M كلوريد الصوديوم ، و 0.1٪ Tween 20) عن طريق كشطها بملعقة في أنبوب سعة 15 مل.
   4. التجانس والتصنيف باستخدام معالج بالموجات فوق الصوتية المحمولة باليد ، كما هو موضح في الخطوة 1.5 ، أو فقط عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات ؛ هذا يعد العينة للتحليل بواسطة المصفوفة الدقيقة.
2. مستخلص Multianalyte من عينة صلبة
   1. قم بوزن ما يصل إلى 0.5 جم من العينة الصلبة (على سبيل المثال ، الصخور أو التربة أو الرواسب) في أنبوب سعة 10 مل وأضف ما يصل إلى 2 مل من TBSTRR.
   2. صوتي عن طريق غمر مسبار الصوتنة في الأنبوب ، عن طريق غمس الأنبوب في الحمام المائي لقرن صوتي قوي ، أو باستخدام مكبر صوتي محمول باليد. قم بإجراء ما لا يقل عن 5 × 30 دورة ثانية عند 30 كيلو هرتز ، وتوقف لمدة 30 ثانية أثناء وجوده على الجليد.
   3. قم بتصفية لإزالة الرمل والطين والمواد الخشنة الأخرى باستخدام حقنة سعة 10 مل مقترنة بحامل مرشح نايلون بقطر 10 إلى 12 مم ، وحجم المسام من 5 إلى 20 ميكرومتر. ادفع العينة عبر الفلتر إلى أنبوب سعة 1.5 مل. إذا كان الفلتر مشبعا ، فقم بتحريك التعليق في المحقنة ونقله إلى حقنة جديدة ؛ هذا يجهز مادة الترشيح للمقايسة المناعية (الخطوة 7).
      ملاحظة: تعتمد سعة التخزين المؤقت ل TBSTRR على نوع العينة. من المهم إجراء المقايسة المناعية مباشرة بعد تحضير المستخلص البيئي لتجنب تأثير التحلل الأنزيمي على التحليلات. بدلا من ذلك ، أضف مثبطات الإنزيم البروتيني إلى المستخلص البيئي وقم بتجميدها عند -80 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.

< p class = "jove_title" >7. المقايسة المناعية Microarray Sandwich الفلورية (FSMI)

1. حظر CYANOCHIP
   ملاحظة: قبل الاستخدام مباشرة ، قم بمعالجة الشرائح المطبوعة لحجب جميع مجموعات الإيبوكسي الحرة على الشريحة وإزالة الأجسام المضادة الزائدة غير المرتبطة تساهميا.
   1. اغمر المصفوفة الدقيقة في 0.5 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 9) مع محلول BSA بنسبة 5٪ (وزن / حجم) على سطح نظيف (على سبيل المثال ، طبق بتري أو أنبوب سعة 50 مل) مع تحريك خفيف من منصة هزاز لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك ، ضع الشريحة لأسفل على قطرة من 100 إلى 200 ميكرولتر من المحلول أعلاه مع مواجهتها لبقع المصفوفة الدقيقة. اتركيه لمدة 3 - 5 دقائق ثم تابع.
   2. التقط الشريحة بعناية باستخدام ملقط بلاستيكي ؛ حاول تجنب لمس مناطق المصفوفات الدقيقة. تخلص من السائل الزائد عن طريق ضرب الشريحة برفق على منشفة ورقية. اغمره في 0.5 متر Tris-HCl (درجة الحموضة 8) مع محلول BSA بنسبة 2٪ (وزن / حجم) لمدة 30 دقيقة مع تحريك خفيف من منصة هزاز.
   3. جفف الشريحة عن طريق إجراء طرد مركزي قصير (200 - 300 × جم لمدة دقيقة واحدة) باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق تجاري مكيف لشرائح المجهر. بدلا من ذلك ، جفف الشريحة عن طريق الطرق برفق على منشفة ورقية.
2. حضانة مستخلص العينة متعددة التحليلات مع المصفوفة الدقيقة
   1. قم بإعداد الشريحة في كاسيت تهجين مصفوفة صغيرة تجاري مع 24 بئرا لمصفوفات دقيقة متعددة ؛ اتبع تعليمات المزود.
   2. بعد تجميع الانزلاق والكاسيت، قم بإدخال ماصة تصل إلى 50 ميكرولتر من مستخلص العينة أو تخفيفها في TBSTRR في كل بئر من الكاسيت.
   3. كرر الخطوة 7.2.2 لكل عينة لتحليلها.
   4. كعنصر تحكم فارغ ، يتم وضع ماصة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت TBSTRR في بئرين منفصلين على الأقل من الكاسيت.
   5. احتضن في درجة الحرارة المحيطة لمدة 1 ساعة مع الخلط عن طريق سحب العينات كل 15 دقيقة أو عن طريق تركه تحت اهتزاز خفيف. بدلا من ذلك ، احتضن لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية
      ملاحظة: استخدم حشوات الحضانة الأخرى كدالة لنمط المصفوفة الدقيقة. يعد وقت ودرجة حرارة الحضانة في الخطوة 7.2.5 معلمات تجريبية تعتمد عادة على التقارب وحركية الربط لكل جسم مضاد مضاد مقترن.
3. غسل
   1. قم بإزالة العينات عن طريق وضع الكاسيت لأسفل ووضعه بحذر على ورق نظيف وماص.
   2. اغسل الآبار بإضافة 150 ميكرولتر من TBSTRR إلى كل واحدة ، وتخلص من المخزن المؤقت ، على النحو الوارد أعلاه.
   3. كرر الخطوة 7.3.2 ثلاث مرات أخرى.
4. حضانة الأجسام المضادة للكاشف الفلوري
   1. أضف 50 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الذي يحتوي على 17 أجساما مضادا مضادا للبكتيريا الزرقاء ، كل منها مسمى بالفلوروكروم في TBSTRR مع 1٪ (وزن / حجم) BSA. تحديد تركيز كل جسم مضاد فلوري في الخليط (من 0.7 إلى 2 ميكروغرام/مل) عن طريق إجراء تجارب المعايرة لكل زوج من زوج المستضد/الأجسام المضادة.
   2. احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة الحرارة المحيطة ، كما هو موضح في الخطوة 7.2.5 ، أو لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
5. غسل الأجسام المضادة الفلورية
   1. قم بإزالة الأجسام المضادة الفلورية غير المرتبطة ، كما في الخطوة 7.3.
   قم
   2. بفك الكاسيت واغمر الشريحة في 0.1x PBS (على سبيل المثال ، في أنبوب سعة 50 مل) لشطف سريع.
   3. جفف الشريحة كما في الخطوة 7.1.3.

< p class = "jove_title" >8. المسح الضوئي بحثا عن التألق

1. امسح الشريحة بحثا عن التألق عند ذروة مضان الانبعاث القصوى بحثا عن صبغة الفلورسنت ذات اللون الأحمر البعيد في ماسح ضوئي للتألق. التقط عدة صور للمصفوفات الدقيقة بمعلمات مسح مختلفة ، بشكل عام عن طريق خفض قيمة كسب الليزر.
   ملاحظه: تجنب البقع المشبعة (> 65,000 عدد من التضمينات) - فهي خارج النطاق وقد تؤدي إلى أخطاء في القياس الكمي.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. قائمة الأجسام المضادة (ABS) والسلالات الزرقاء المستخدمة لإنتاج CYANOCHIP.

كود أب المناعة (سلالة) ترتيب الموئل متوسط ظروف الثقافة ك 1 أنابينا ص. Nostocales مجهول BG11 والنترات 30 درجة مئوية ، ضوء مستمر ك 2 أنابينا ص. Nostocales مجهول BG11o 30 درجة مئوية ، ضوء مستمر ك 3 Microcystis flosaquae كروكوكاليس العوالق بي جي 11 28 درجة مئوية ، ضوء مستمر ك 4 Microcystis novacekii كروكوكاليس العوالق بي جي 11 28 درجة مئوية ، ضوء مستمر ك 5 الميكروكيستيس الزنجاري كروكوكاليس العوالق بي جي 11 28 درجة مئوية ، ضوء مستمر ك 6 Aphanizomenon ovalisporum Nostocales العوالق BG11o 28 درجة مئوية ، ضوء مستمر ك 7 فورميديوم ص. التذبذبات القاعيه بي جي 11 18 درجة مئوية ، 16-8 فترة ضوئية ك 8 Rivularia ص. Nostocales القاعيه تشو د 18 درجة مئوية ، 16-8 فترة ضوئية ك 9 Chamaesiphon ص. كروكوكاليس القاعيه بي جي 11 18 درجة مئوية ، 16-8 فترة ضوئية ك 10 Leptolyngbya بوريانا التذبذبات القاعيه بي جي 11 18 درجة مئوية ، 16-8 فترة ضوئية ك 11 توليبوثريكس ديستورتا Nostocales القاعيه BG11o 18 درجة مئوية ، 16-8 فترة ضوئية ك 12 أفانيزومينون أفانيزومينويد Nostocales العوالق BG11o 28 درجة مئوية ، ضوء مستمر ك 13 Nostoc sp. (القارة القطبية الجنوبية) Nostocales القاعيه BG11o 13 درجة مئوية ، 16-8 فترة ضوئية ك 14 أنابينا ص. Nostocales القاعيه BG11o 13 درجة مئوية ، 16-8 فترة ضوئية ك 15 Leptolyngbya ص. التذبذبات القاعيه بي جي 11 13 درجة مئوية ، 16-8 فترة ضوئية ك 16 توليبوثريكس ص. Nostocales القاعيه بي جي 11 13 درجة مئوية ، 16-8 فترة ضوئية ك 17 العوالق الروبسين التذبذبات العوالق اي اي

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرشحات قطر المسام 0.22 مم ميليبور GSWP04700 لتحضير الجينات المناعية جهاز طرد مركزي دقيق Eppendorf 5424R فيشر ساينتيك لتحضير الجينات المناعية محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) درجة الحموضة 7.4 (10X) ثيرموفيشر العلمي 70011036 50 ملي فوسفات البوتاسيوم ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.4 معالج بالموجات فوق الصوتية UP50H هيلشر لتحضير الجينات المناعية أكمل مساعد فرويند سيجما ألدريتش F5881 القوة المناعية مساعد فرويد غير مكتمل سيجما ألدريتش F5506 لحقن التعزيز مجموعة تنقية الأجسام المضادة للبروتين أ سيجما ألدريتش بيور 1 أ لعزل IgG أجهزة تصفية الطرد المركزي MWCO<100 KDa ميليبور UFC510096-96 كيلو لعزل IgG أنابيب غسيل الكلى ، بنزويلات سيجما ألدريتش D7884-10FT لعزل IgG أعمدة Illustra Microspin G-50 جنرال إلكتريك - الرعاية الصحية GE27-5330-02 لعزل IgG كاشف برادفورد سيجما ألدريتش B6916-500 مل لتحديد تركيز الجسم المضاد مجموعة فحص البروتين MicroBCA الترمو: العلمية هاتف: 23235 لتحديد تركيز الجسم المضاد مجموعة البروتين العازلة 2X واتمان (سيجما ألدريتش) S00537 المخزن المؤقت للطباعة ؛ 30-40٪ جلسرين في 1X PBS مع 0.01٪ Tween 20 توين 20 سيجما ألدريتش ص 9416 منظف غير أيوني ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش أ 9418 التحكم في الطباعة ؛ حجب الكاشف 384 بئر صفيحة دقيقة جينيتكس إكس 6004 لطباعة الأجسام المضادة مصفوفة روبوت لشرائح متعددة مصفوفة MicroGrid II TAS من Digilab لطباعة الأجسام المضادة شرائح زجاجية الركيزة الايبوكسي شركة الرايط VEPO25C دعم قوي لطباعة الأجسام المضادة أليكسا فلور -647 سوكسينيميديل إستر المجسات الجزيئية أ 20006 فلوروكروم DMSO سيجما ألدريتش د8418 مذيب الفلوروكروم هايدولف تيتراماكس تهتز منصة شاكر فيشر ساينتيك لوضع العلامات على الأجسام المضادة أعمدة Illustra Microspin G-50 الصحيه 27-5330-01 لتنقية الأجسام المضادة المصنفة أنبوب بني آمن 0.5 مل سارستيدت 7,27,04,001 ريال لتخزين الأجسام المضادة المصنفة مقياس الطيف الضوئي Nanodrop 1000 الترمو: العلمية لتحديد تركيز الأجسام المضادة وكفاءة وضع العلامات 3 ميكرومتر حجم المسام البولي كربونات 47 مم قطر مرشح ميليبور TMTP04700 لتركيز الخلايا 1M محلول هيدروكلوريد Trizma درجة الحموضة 8 سيجما ألدريتش تي 3038 لإعداد TBSTRR ؛ لمنع الشرائح كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش إس 7653 لتحضير TBSTRR مرشحات نايلون 20 ميكرومتر ميليبور NY2004700 لتحضير المستخلصات البيئية حاملات مرشح 10-12 مم ميليبور SX0001300 لتحضير المستخلصات البيئية كوكتيل مثبط البروتياز سيجما ألدريتش ص 8340 لتخزين المستخلصات البيئية محلول هيدروكلوريد Trizma 1M درجة الحموضة 9 سيجما ألدريتش تي 2819 لحظر الشرائح هايدولف Duomax 1030 هزاز منصة شاكر VWR لحظر الشرائح؛ لعمليات الحضانة جهاز الطرد المركزي الدقيق VWR Galaxy miniarray VWR C1403-VWR لتجفيف الشرائح كاسيت تهجين المصفوفات الدقيقة متعدد الآبار شركة الرايط AHC1X24 كاسيت ل 24 فحصا لكل شريحة ماسح ضوئي GenePix 4100A microarray الأجهزة الجزيئية ماسح ضوئي للفلورة برنامج GenePix Pro الأجهزة الجزيئية برنامج لتحليل الصور وقياسها