التلوين المناعي للخلايا المغلفة في نظام هيدروجيل ثلاثي الأبعاد

الملخص

المصدر: LeSavage، B.L.، et al. إنتاج الهلاميات المائية البروتينية الشبيهة بالإيلاستين لتغليف الخلايا وتلوينها المناعي في 3D. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتلطيخ الخلايا المناعية المغلفة في هيدروجيل ثلاثي الأبعاد. يتم إصلاح ثقافة الهيدروجيل التي تحتوي على خلايا سلف عصبية ونفاذها ومعالجتها بمحلول مانع لمنع التلوين المناعي غير المحدد. يضاف كوكتيل الأجسام المضادة الأولية لربط بروتينات معينة ، تليها أجسام مضادة ثانوية مصنفة بالفلورسنت وصبغة نووية. ثم يتم تركيب العينة على شريحة ومراقبتها تحت مجهر متحد البؤر.

البروتوكول

فئة

1. تغليف الخلايا في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد الشبيهة بالبروتين (ELP)

1. تحضير قوالب السيليكون
   1. استخدم ثقب خزعة بالقطر المطلوب لإنشاء ثقوب في لوح سيليكون بسمك 0.5 مم وقطع مربع حول كل ثقب. كرر لعدد القوالب المطلوبة.
      ملاحظة: يمكن تعديل قطر وسمك القوالب وفقا للتطبيق المعين وظروف زراعة الخلايا. من الناحية العملية ، بالنسبة للمزارع الخلوية التي يبلغ حجمها 50 × 10⁶ خلايا / مل ، يوصى باستخدام قوالب بسمك 0.5 مم بأقطار 4 مم و 5 مم لاستخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي والبروتين ، على التوالي. بالنسبة للتلوين المناعي ، يمكن استخدام لكمة خزعة 2 مم لإنشاء ثلاثة ثقوب متجاورة لكل قالب مربع بحيث يمكن تلطيخ ثلاث نسخ مكررة لكل بئر.
   2. قم بإزالة الغلاف البلاستيكي على كل جانب من جوانب القالب الفردي باستخدام ملاقط.
      ملاحظه: تجنب ملامسة سطح السيليكون المكشوف لأن التلوث يمكن أن يقلل من كفاءة ربط البلازما في المستقبل.
   3. باستخدام الملقط ، رتب نفس العدد من قوالب السيليكون العارية والأغطية الزجاجية (رقم 1 ، قطر 12 مم) في صفوف متناوبة على الغطاء المقلوب للوحة 48 بئرا. بمجرد الانتهاء ، قم بتغطية غطاء اللوحة المكونة من 48 بئرا لتجنب التلوث.
   4. تعالج بلازما الأكسجين غطاء اللوحة المكون من 48 بئرا بالكامل (أي القوالب والشرائح الزجاجية). بعد ذلك مباشرة ، استخدم الملقط لقلب قالب السيليكون على الغطاء الزجاجي المجاور. اضغط بقوة على القالب لضمان الترابط. دع القوالب تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة < / > ملاحظه: تختلف مدة العلاج ببلازما الأكسجين حسب الأداة المستخدمة. الظروف النموذجية لأداتنا هي نافذة ضغط غاز التشغيل بين 0.3-4 ملي بار ، وتدفق غاز الأكسجين عند 20 سم³ / دقيقة ، والتعرض للعينة للبلازما لمدة 10-20 ثانية.
   5. تعقيم القوالب عن طريق التعقيم. قم بتخزين القوالب في درجة حرارة الغرفة في بيئة معقمة حتى الاستخدام.
      ملاحظه: يمكن تخزين القوالب في هذه المرحلة إلى أجل غير مسمى.
2. تحضير محلول مخزون البروتين الشبيه بالإيلاستين
   1. قم بإزالة ELP المجفف بالتجميد من تخزين 4 درجات مئوية. قم بتسخين البروتين إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح الأنبوب لضمان عدم تراكم أي تكاثف على البروتين أثناء الاستخدام المتكرر.
   2. قم بإذابة ELP في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco عند 4 درجات مئوية مع تحريك مستمر (أي الدوران) طوال الليل.
      ملاحظه: سيتم تخفيف تركيز محلول مخزون ELP بشكل أكبر مع إضافة محلول الربط المتقاطع بنسبة حجمية يحددها المستخدم. على سبيل المثال ، للحصول على تركيز ELP نهائي بنسبة 3٪ (وزن / حجم) ، قم بإعداد محلول مخزون ELP بنسبة 3.75٪ (وزن / حجم) سيتم تخفيفه بنسبة حجمية 4: 1 من محلول ELP: محلول الربط المتقاطع. اضبط التركيز حسب الضرورة للتطبيق المطلوب.
   3. محلول مخزون ELP للمرشح المعقم باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين ELP على الثلج عندما لا يكون قيد الاستخدام.
3. في خزانة السلامة الحيوية ، انقل القوالب المعقمة باستخدام ملاقط معقمة إلى لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا.
4. تحضير محلول مخزون كلوريد الفوسفونيوم رباعي (هيدروكسي ميثيل) (THPC)
   1. تمييع THPC في DPBS قبل الاستخدام مباشرة. اضبط تركيز محلول THPC وفقا لتركيز ELP النهائي ونسبة التشابك المطلوبة.
      ملاحظه: بالنسبة للبروتوكول ، سيتم إجراء تركيز ELP نهائي بنسبة 3٪ (وزن / حجم) عن طريق خلط محلول مخزون ELP مع محلول THPC بنسبة حجمية تبلغ 4: 1. اضبط حسب الضرورة.
   2. أضف 2.6 ميكرولتر من محلول THPC (80٪ في الماء) إلى 997.4 ميكرولتر من DPBS.
      ملاحظه: يتوافق هذا التركيز من THPC مع نسبة متكافئة 1: 1 لمجموعات هيدروكسي ميثيل على THPC والأمينات الأولية على بروتين ELP عند خلط المحاليل عند النسبة الحجمية الموصوفة 4: 1 لهيدروجيل ELP النهائي 3٪ (وزن / حجم). محلول THPC لزج وقد تلتصق قطرات المحلول بجانب طرف الماصة. للحصول على تركيزات دقيقة ، تجنب مثل هذه القطرات عند تخفيفها إلى DPBS. قم بتطهير حاوية مخزون THPC بغاز النيتروجين لمنع أكسدة الفوسفين وتعطيل الرابط المتشابك.
   3. دوامة الحل للخلط والحفاظ على الجليد.
   4. قم بتصفية معقمة لمحلول مخزون THPC باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. قم بتخفيف محلول مخزون THPC بشكل أكبر باستخدام DPBS المعقم لتحقيق نسب تشابك متكافئة أقل (على سبيل المثال ، 0.5: 1 أو 0.75: 1).
      ملاحظه: THPC حساس للأكسجين ، ويجب استخدام المحلول المخفف في غضون ساعات قليلة بعد التحضير.
5. قم بفصل الخلايا عن طريق الحضانة باستخدام Trypsin-EDTA في معلق أحادي الخلية ، وحبيبات الخلايا ، وعد الخلايا المعاد تعليقها في وسط باستخدام مقياس كثافة الدم.
   ملاحظه: ستعتمد البروتوكولات الدقيقة لهذه الخطوة بشكل كبير على نوع الخلية المطلوبة والتطبيق. بالنسبة للخلايا السلفية العصبية المستخدمة في جميع أنحاء هذا البروتوكول ، تم إجراء حضانة Trypsin-EDTA بنسبة 0.025٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 دقيقة. تم تكوير الخلايا عند 200 × جم لمدة دقيقتين. لزيادة صلاحية الخلية ، يجب تعليق الخلايا في الظروف المتوسطة العادية. تتراوح كثافة الخلايا النموذجية المستخدمة في تغليف الخلايا من 1 إلى 50 × 10⁶ خلايا / مل من حجم الهيدروجيل النهائي. اضبط حسب الضرورة.
6. اقتبس العدد المطلوب من الخلايا في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل.
7. الطرد المركزي للخلايا عند ~ 200 × جم لمدة 3 دقائق. بعناية ، قم بشفط المادة الطافية واحتفظ بحبيبات الخلية على الجليد.
   ملاحظه: من الأهمية بمكان أن تستنشق كل المادة الطافية بالكامل للتخفيف من التخفيف الإضافي للرابط المتشابك ELP و THPC. ستختلف سرعات الطرد المركزي المحددة باختلاف نوع الخلية.
8. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول مخزون ELP بحيث يكون الحجم 80٪ من الحجم النهائي (بافتراض نسبة 4: 1 من محلول ELP: محلول THPC). تخلط الماصة 20-25 مرة لإنتاج خليط متجانس من الخلايا و ELP.
   ملاحظه: تجنب الإمساك بالجزء السفلي من الأنبوب للتخفيف من زيادة درجة الحرارة وانتقال الطور اللاحق ل ELP. يتطلب كل قالب 2 مم مع ثلاث نسخ مكررة 7.5 ميكرولتر من الحجم النهائي (أي 6 ميكرولتر من محلول مخزون ELP و 1.5 ميكرولتر من محلول مخزون THPC) مقسمة بالتساوي إلى 3 ثقوب (أي 2.5 ميكرولتر الحجم النهائي لكل حفرة). بالنسبة للقوالب 4 و 5 مم ، يلزم وجود حجم نهائي يبلغ 7.5 ميكرولتر و 15.5 ميكرولتر ، على التوالي.
9. أضف محلول مخزون THPC إلى تعليق الخلية / ELP للحجم النهائي المتبقي بنسبة 20٪. تخلط الماصة 20-25 مرة لإنتاج خليط متجانس.
10. قم على الفور بإدخال الأحجام النهائية المقابلة لخليط الخلية / ELP / THPC في كل قالب بحركة دائرية. كرر لجميع القوالب.
11. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، متبوعة بحضانة إضافية عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة < br / > ملاحظه: ستساعد فترة الحضانة الأولى في تسهيل التشابك الأولي للهيدروجيل قبل زيادة درجة الحرارة إلى تلك التي تزيد عن درجة حرارة المحلول الحرج المنخفضة (LCST) ل ELP وتحفيز فصل الطور الحراري.
12. أضف ببطء 750 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الدافئة إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا ، وتجنب تعطيل المواد الهلامية.
13. احتضن الهلاميات المائية عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
    ملاحظه: يوصى بإجراء تغييرات متوسطة كاملة كل 1-2 أيام حسب نوع الخلية. للحد من الضغط على الجل، استخدم ماصة باستور زجاجية مثبتة بطرف ماصة سعة 200 ميكرولتر عند شفط وسط من البئر.

فئة

2. الكيمياء الخلوية المناعية للخلايا في الهلاميات المائية 3D ELP

1. تحضير محلول التثبيت عن طريق خلط 10 مل 16٪ (وزن / حجم) بارافورمالدهيد (PFA) في 30 مل من DPBS. قم بتسخين المحلول إلى 37 درجة مئوية.
2. استنشق الوسط من اللوحة المكونة من 24 بئرا واغسلها برفق باستخدام 1 مل من DPBS.
3. أضف 750 ميكرولتر من محلول التثبيت إلى كل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لا تستخدم حاضنة زراعة الأنسجة لتجنب تلوث الثقافات الأخرى ببخار PFA.
4. استنشق محلول التثبيت بعناية من كل بئر ، وتخلص من PFA إلى حاوية نفايات خطرة مناسبة.
   أنذر: يمكن أن يسبب التعرض ل PFA تهيج الجلد والعين. ارتد قفازات / نظارات أمان واعمل في غطاء دخان كيميائي.
5. أضف 1 مل من DPBS إلى كل عينة. قم على الفور باستنشاق DPBS وتخلص منه في حاوية نفايات PFA.
6. اغسل العينات مرتين ب 1 مل من DPBS لمدة 10 دقائق لكل منهما.
   ملاحظه: يمكن تخزين العينات في DPBS عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع بعد إغلاق اللوحة باستخدام Parafilm.
7. نفاذية كل عينة ب 750 ميكرولتر من محلول النفاذية (100 مل من DPBS و 0.25 مل من Triton X-100 ؛ PBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على هزاز عند 15 دورة في الدقيقة.
8. استنشق PBST وأضف 750 ميكرولتر من محلول الحجب (95 مل من PBS ، و 5 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، و 5 مل من المصل ، و 0.5 مل من Triton X-100) لكل عينة. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات على هزاز عند 15 دورة في الدقيقة.
   ملاحظه: يجب أن يحتوي محلول الحجب على مصل من الأنواع المضيفة التي تم فيها رفع الأجسام المضادة الثانوية (مثل الماعز والحمار) وتصفيته معقمة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.
9. تحضير محلول تخفيف الأجسام المضادة (97 مل من DPBS ، 2.5 جم من BSA ، 2.5 مل من المصل (من نفس الأنواع المضيفة التي يتم تحضير EPL منها) ، و 0.5 مل من Triton X-100). قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي باستخدام محلول تخفيف الجسم المضاد وأضف 500 ميكرولتر من المحلول إلى كل عينة. أغلق اللوحة باستخدام Parafilm واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية على هزاز.
   ملاحظه: تم تخفيف الأجسام المضادة الأولية Nestin و Sox2 بنسبة 1: 400 في محلول تخفيف الأجسام المضادة من التركيز الأصلي للمصنعين.
10. قم بشفط محلول الجسم المضاد من كل عينة واغسل العينات باستخدام PBST لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على هزاز عند 15 دورة في الدقيقة. كرر خطوة الغسيل 3 مرات.
11. قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية و 5 مجم / مل مخزون DAPI (1: 2,000) باستخدام محلول تخفيف الجسم المضاد وأضف 500 ميكرولتر من المحلول لكل عينة. قم بتغطية اللوحة المكونة من 24 بئرا بورق الألمنيوم واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية على الروك.
    ملاحظه: نظرا لأن الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء ، يجب حماية العينات من التبييض الضوئي لجميع الخطوات اللاحقة. تم تخفيف الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب المضادة للماعز والماعز بنسبة 1: 500 في محلول تخفيف الأجسام المضادة من التركيز الأصلي للمصنعين.
12. قم بشفط محلول الجسم المضاد من كل عينة واغسل العينات باستخدام PBST لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك. كرر خطوة الغسيل 3 مرات.
13. ضع قطرة من وسط التثبيت الصلب على سطح شريحة زجاجية. باستخدام الملقط ، قم بإزالة المحلول الزائد من القالب عن طريق مسح حافة القالب برفق على منشفة ورقية. ضع القالب رأسا على عقب بحذر على وسط التثبيت وتجنب إدخال الفقاعات.
14. اترك وسط التركيب يتماسك لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية. اترك وسط التركيب يتماسك بالكامل لمدة 48 ساعة قبل التصوير حيث سيتغير معامل الانكسار للوسط على مدار التصلب. أغلق العينات على شريحة الغطاء الزجاجي بطلاء أظافر شفاف للتخفيف من التلوث أو حركة العينة.
15. صور العينات باستخدام مجهر متحد البؤر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات تغليف الخلايا في الهلاميات المائية 3D ELP مرشحات حقنة 0.22 ميكرومتر ميليبور SLGV004SL صفائح سيليكون بسمك 0.5 مم علم المجهر الإلكتروني 70338-05 24 بئر لوحات زراعة الأنسجة كورنينج 353047 لكمة خزعة يمكن التخلص منها (2 مم) إنتيجرا ميلتكس 33-31 لكمة خزعة يمكن التخلص منها (4 مم) إنتيجرا ميلتكس 33-34 لكمة خزعة يمكن التخلص منها (5 مم) إنتيجرا ميلتكس 33-35 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) كورنينج 21-031 سم رقم 1 أغطية زجاجية مقاس 12 مم ثيرمو فيشر العلمي 12-545-80 كلوريد الفوسفونيوم رباعي (هيدروكسي ميثيل) (THPC) سيجما ألدريتش 404861-100 مل 0.5٪ Tryspin / EDTA ثيرمو فيشر 15400054 الكيمياء الخلوية المناعية للخلايا في الهلاميات المائية 3D ELP 16٪ (وزن / حجم) بارافورمالدهيد (PFA) علوم المجهر الإلكتروني 15701 ألبومين مصل الأبقار (BSA) روش 3116956001 DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole، ثنائي هيدروكلوريد) المجسات الجزيئية د1306 مصل الحمار مختبرات لامبير البيولوجية 7332100 الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر (AF488) المجسات الجزيئية أ -11017 الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للأرانب (AF546) المجسات الجزيئية أ -11071 مصل الماعز جيبكو 16210-072 الجسم المضاد الأساسي للفأر نيستين BD Pharmingen 556309 الجسم المضاد الأساسي Mouse Sox2 تقنية إشارات الخلية 23064 ثانية طلاء الأظافر علوم المجهر الإلكتروني 72180 تريتون X-100 سيجما ألدريتش X100-100 مل Vectashield Hardset تصاعد متوسط مختبرات ناقلات H-1400