$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. اقتران ببتيد الأجسام المضادة
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: يمكن تصنيع حمض الكوليك المرتبط ب NLS (ChAcNLS) في أي مصنع ببتيد تجاري أو منصة خدمة تخليق الببتيد التابعة للجامعة.
- في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.7 مل ، قم بإعداد محلول 10 مجم / مل (~ 1 مجم إجمالي الجسم المضاد) من 7G3 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.6.
- قم بإذابة سلفوسوكسينميديل 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) بتركيز 5-10 ملي مولار. يعمل دوامة الحل بدقة بشكل أفضل من أجل تحقيق الذوبان الكامل.
- أضف إلى الأنبوب الذي يحتوي على 7G3 محلول الكبريت SMCC المذاب (عادة بين 5-20 ميكرولتر اعتمادا على النسبة المولية ل sulfo-SMCC-to-7G3 المطلوبة). يوصى باختبار نسب sulfo-SMCC-to-7G3 من 10 و 25 و 50 إلى 1. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- قم بتنقية وتركيز 7G3 المشتق من الماليميد باستخدام جهاز الترشيح الفائق وتبادل العازلة في PBS ، درجة الحموضة 7.0. جهاز طرد مركزي عند 8,000 × جم لمدة 5 دقائق تقريبا. تخلص من التدفق واملأه ب PBS و pH 7.0 و جهاز الطرد المركزي مرة أخرى.
- قم بإجراء ذلك 7-8 مرات لاستبدال المخزن المؤقت بالكامل. استرجع بروتين 7G3 المركز عن طريق وضع جهاز المرشح رأسا على عقب في أنبوب نظيف لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1,000 × جم. يجب أن يكون حجم الاسترداد حوالي 0.3 مل.
- في الأنبوب الذي يحتوي على 7G3 المنشط بالماليميد ، أضف 2 ضعفا من المولار الزائدة من ChAcNLS بالنسبة لنسبة sulfo-SMCC-to-7G3 المستخدمة في الخطوة السابقة واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام نسبة 10 إلى 1 sulfo-SMCC-to-7G3 ، فاستخدم نسبة 20 إلى 1 ChAcNLS-to-7G3. لا ينبغي تغيير الحجم الإجمالي بشكل كبير.
ملاحظه: على الرغم من أن ChAcNLS لا يسبب هطول الأمطار أثناء عملية الاقتران ، إلا أن هذا احتمال يمكن أن يحدث مع الببتيدات الأخرى. راقب الأنبوب أثناء التفاعل بحثا عن علامات هطول الأمطار ، والذي يحدث على الأرجح عندما تكون الببتيدات كارهة للماء. في هذه الحالات ، قد يكون من المفيد إعادة النظر في الببتيد محل الاهتمام من أجل تصميم التغييرات لتوفير زيادة المحبة للماء.
- قم بتركيز 7G3-ChAcNLS باستخدام جهاز الترشيح الفائق إلى التركيز المطلوب وتبادل المخزن المؤقت في PBS pH 7.4 (انظر الخطوة 1.4). يجب أن يكون عائد الاسترداد للبروتين الكلي ≥ 75٪ من مادة البداية الأصلية.
- قم بإجراء الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) لتقييم مرشحي 7G3-ChAcNLS المبنيين باستخدام هلام بولي أكريلاميد بنسبة 12٪ (يوفر فصلا كافيا للسلاسل الثقيلة والخفيفة المترافقة ChAcNLS من السلاسل غير المترافقة). امزج 10 ميكروغرام من 7G3-ChAcNLS في مخزن تحميل PAGE يحتوي على 2 ميكرولتر β-mercaptoethanol وقم بتحميله في البئر.
- اضبط الجهد المناسب (120 فولت لمدة ساعة لمدة 12٪ هلام) وقم بتشغيل الرحلان الكهربائي. أوقف الرحلان الكهربائي عندما تصل مقدمة صبغة Coomassie إلى قاع الجل.
ملاحظه: لا تدع صبغة Coomassie الأمامية تنفد من الجل.
- قم بإزالة الجل من جهاز الرحلان الكهربائي واشطفه بمحلول إزالة البقع الذي يحتوي على 10٪ v / v من حمض الأسيتيك الجليدي و 20٪ v / v / v الميثانول.
- التقط صورة للهلام وباستخدام مسطرة وقم بقياس المسافة (سم) التي تم ترحيلها للمعايير و 7G3 المترافقات. احسب قيمة عامل الاستبقاء (Rf) ، وهي المسافة التي تم ترحيلها مقسومة على طول الهلام (من حيث يتم تحميل البروتين إلى جبهة هجرة Coomassie). ارسم الوزن الجزيئي (MW) في السجل مقابل قيم الترددات اللاسلكية من كل معيار بروتين واستقراء حجم 7G3 المترافقات.
- احسب عدد الببتيدات لكل جسم مضاد بقسمة الفرق في ميغاواط بين 7G3 المترافقات و 7G3 غير المعدل على 1768.5 جم / مول (ميغاواط من ChAcNLS).
- التقط صورا رقمية للهلام الملون بالكوماسي وقم بإجراء تحليل قياس الكثافة. في هذه المرحلة ، يمكن أن يعتمد اختيار المرشح الرئيسي على التيار المتردد مع الحد الأقصى لعدد جزيئات ChAcNLS التي لا تحتوي على أنواع مجمعة كبيرة.
< p class = "jove_title" >
2. الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم التراكم داخل الخلايا
ملاحظة: من المهم اختبار انتقائية الخلية للتراكم داخل الخلايا ل mAbs المعدلة بالببتيد قبل تطوير تركيبات ذات حمولة ذات أهمية. نظرا لأنه ثبت أيضا أن Tat لديه ميل لاختراق الخلايا غير المحدد ، فإن الأمر يستحق أولا تحليل التراكم داخل الخلايا وانتقائية الخلية قبل اتخاذ خطوات تطوير مكلفة مع حمولات باهظة الثمن. لهذا السبب ، يجب أن يعدل الإجراء 1 أيضا mAbs التحكم غير ذي الصلة الخاصة بالنمط المتموي. بالنسبة لبقية البروتوكول ، سنعمل مع ACs المعدلة ب 10 جزيئات ChAcNLS لكل جسم مضاد. ويرد في الشكل 1 وصف مخطط يتضمن الخطوات الرئيسية للإجراءين 2 و3.
CAUTION: تتضمن هذه الخطوة من البروتوكول التعامل مع بارافورمالدهايد ومعالجته. يرجى اتباع تعليمات الشركة المصنعة عند المناولة.
- عالج خلايا TF-1a المستهدفة ب 200 نانومتر من 7G3-ChAcNLS بما في ذلك mAbs التحكم المعدل. احتضان 5 × 106 خلايا إيجابية للمستضد مع المترافقات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- بعد 1 ساعة ، قم بإزالة المادة الطافية واغسلها ب 1 مل 3x في PBS المثلج. أضف وسائط جديدة واحتضن لمدة ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية.
- بعد الساعة الإضافية ، قم بإزالة المادة الطافية وغسل 3 مرات في 1 مل من PBS المثلج. أضف 0.5 مل من PBS يحتوي على 0.25٪ تريبسين وحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) عند 37 درجة مئوية لمدة 3 حتى 30 دقيقة <br / >
ملاحظه: أثناء الاختبار التجريبي الأولي ، يوصى بعدم تربسين الخلايا من أجل تحديد الاختلافات في تراكم التيار المتردد داخل الخلايا. يعزز هذا البروتوكول استخدام التربسين ، ونوضح كيف يحسن هذا تقييم كفاءة التراكم داخل الخلايا لمرشحات التيار المتردد المختلفة.
- اختبر الأوقات المختلفة للحضانة عن طريق التحقق بصريا من جميع الخلايا التي يتم فصلها. بالإضافة إلى ذلك ، احتضان حصوات الخلية مع حلول تلطيخ الجدوى وإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا.
- تحييد التربسين باستخدام 1.5 مل من مزرعة الخلايا RPMI 1640 media/10٪ مصل بقري للجنين. خلايا الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية ، وغسل 3x في 0.5 مل من PBS المثلج.
- قم بإصلاح الخلايا في 0.5 مل PBS تحتوي على 1٪ بارافورمالدهيد و 1٪ سكروز على الجليد لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا 3x في 0.5 مل PBS بارد مثلج وأجهزة طرد مركزي بمعدل 250 × جم لمدة 5 دقائق. اغسل الخلايا في PBS المثلج وكرر الطرد المركزي.
- قم بتعليق الخلايا في 0.1 مل PBS تحتوي على 2 ميكروغرام / مل (أو التركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة) من جسم مضاد متعدد النسيلة الثانوي Fc المضاد للفئران (النوع المتماثل) المقترن ب AlexaFluor 647 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- جهاز طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق وغسل الخلايا 3x في 0.5 مل من PBS المثلج. تعليق الخلايا في 0.5 مل PBS.
تورع: يمكن تخزين الخلايا في الثلاجة.
ملاحظه: من الضروري اختيار جسم مضاد ثانوي يتعرف على النمط الإسوي الصحيح ل mAb محل الاهتمام. يتم اختيار AF647 بسبب انبعاثه بالأشعة تحت الحمراء البعيدة ، والذي لا يتداخل مع تلطيخ يوديد البروبيديوم (PI) للنواة.
- أضف PI إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل إلى الحاوية التي تحتوي على خلايا. بعد ذلك ، قم بتركيب 1 × 105 خلايا على شرائح زجاجية باستخدام وسائط التثبيت وتغطيتها بغطاء زجاجي.
- افحص الخلايا باستخدام هدف غمر الزيت Plan Apo 60X NA 1.42 على مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر المقلوب. اكتشف تألق PI باستخدام ليزر الأرجون 488 نانومتر ومنشور المسح الطيفي المحدد ل 600 - 650 نانومتر. بالنسبة لمضان AF647 ، استخدم ليزر الهيليوم النيون 633 نانومتر ومنشور المسح الطيفي المحدد ل 650 - 700 نانومتر. اجمع انبعاثات التألق من PI و AF647 بالتتابع.
ملاحظه: استخدم نفس الإعداد خلال تقييم الخلايا ومقارنتها. ومع ذلك ، سيتعين عليك ضبط إعدادات الخلايا المثقببة مقارنة بالخلايا غير التربسينية.
- استخدم برنامج المجهر للحصول على الصور. اجمع الصور باستخدام مقاطع بصرية أفقية تسلسلية تبلغ 1,024 × 1,024 بكسل مع متوسط خط 2X تم التقاطها على فترات 0.5 ميكرومتر عبر سمك الخلية بالكامل. اعرض الصور كإسقاطات z مكدسة من أربع شرائح متتالية بأقصى شدة مضان
- تحليل الخلايا باستخدام برنامج المجهر. سجل نمط التوزيع الخلوي للمترافقات. على وجه التحديد ، قم بتقييم ما إذا كان التألق داخل الخلايا في السيتوبلازم مجمعا وبالقرب من سطح الخلية أو منتشر ومتجانس. قم أيضا بتقييم شدة التألق النسبية لكل خلية.
