التسريب الخاضع للرقابة للأجسام المضادة الخاصة بالببتيد Aβ وقلة Aβ في الحصين الفئران

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Sajadi، A.، et al. يتم مواجهة التنكس العصبي في نموذج حيواني لتسريب أوليغومر أميلويد بيتا المزمن عن طريق علاج الأجسام المضادة الممزوج بالمضخات التناضحية. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو تقنية للضخ المستمر للأجسام المضادة الخاصة بالببتيد أميلويد بيتا (Aβ) في الحصين للفئران. تستخدم الدراسة زرع نظام قنية ثنائي لتسريب متحكم فيه للأجسام المضادة الخاصة بالببتيد Aβ إلى جانب ضخ أوليغومرات Aβ القابلة للذوبان (Aβo) في الحصين الفئران لدراسة التفاعلات بين القلة والأجسام المضادة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير القسطرة قبل الجراحة التجسيمية

1. قطع قسطرة PE50 (طولها 6 سم) والتي سيتم استخدامها لتوصيل القنية بالمضخات التناضحية (انظر الشكل 1). املأ قسطرة PE50 بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) وأغلق طرفي القسطرة. احتفظ بالقسطرة على حرارة 4 درجات مئوية حتى تستخدمها.

< p class = "jove_title" >2. زرع القنية عن طريق Stereotaxy

1. إجراء الجراحة في ظروف معقمة. تعقيم جميع الأدوات والمواد الجراحية عن طريق التعقيم. قم بتنظيف الجهاز التجسيمي ومنطقة العمل جيدا وتطهيره بمحلول إيثانول بنسبة 70٪. ارتد قناعا جراحيا وغطاء للشعر وقفازات معقمة.
2. تخدير الفئران عن طريق حقن محلول الكيتامين والزيلازين داخل الصفاق (i.p.) (100 مجم / كجم و 10 مجم / كجم ، على التوالي). تأكد من التخدير عن طريق فحص الحركة بعد قرصة لطيفة على إصبع القدم.
3. حقن دواء مضاد للالتهابات غير الستيرويدي (ميلوكسيكام؛ 1 ملغم/كغ) تحت الجلد (العقد) للحيوان المخدر قبل 30 دقيقة على الأقل من الجراحة.
4. حلق رأس باستخدام المقص وتطهير الجلد ثلاث مرات بمحلول غلوكونات الكلورهيكسيدين 2٪ وكحول الأيزوبروبيل 2٪. ضع مرهم العيون البيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
5. ضع على إطار تجسيمي مع قضبان الأذن. إصلاح قنية واحدة على ذراع حامل الإطار التجسيمي. حقن (s.c.) عامل تخدير موضعي (بوبيفاكائين (1.5 مجم / كغ) وليدوكائين (1.5 مجم / كغ) في الجزء العلوي من الرأس. يتم الحفاظ على التخدير خلال العملية بأكملها عن طريق وضع مخروط أنف يولد 3٪ من الأيزوفلوران. يجب أن يكون المجال الجراحي بأكمله ملفوفا ، ولكن لم يتم إجراؤه هنا لإثبات التقنية بشكل أفضل.
6. قم بعمل شق 3 سم في الجزء العلوي من الرأس بمشرط. قم بتثبيت 4 مشابك حول الشق لترك الجمجمة نظيفة. باستخدام مقص دائري الرأس ، اصنع جيبا (2 × 2 سم²) تحت الجلد بين لوحي كتف.
7. اكشط السمحاق من الجمجمة بشفرة. ضع وسادة شاش على الجمجمة إذا كانت تنزف.
8. تحقق من أن الجمجمة مسطحة ومحاذاة جيدا على الإطار التجسيمي. للتأكد من أن الجمجمة مسطحة ، تحقق من إحداثيات الارتفاع عند بريجما ولامدا. خذ إحداثيات بريجما التي سيتم استخدامها كنقطة مرجعية.
9. بدءا من البريجما ، احسب إحداثيات قنية التوجيه التي سيتم زرعها ثنائيا في الحصين (الأمامي الخلفي: - 0.42 سم ؛ الوسطي الجانبي: ± 0.30 سم ؛ الظهري البطني: - 0.28 سم وفقا لأطلس دماغ الفئران Paxinos و Watson). حدد موضع القنية بعلامة.
10. حفر ثقب (0.5 مم) في الجمجمة عند نقطة زرع كلا القنيات. قم بحفر فتحتين أخريين بطول 5 مم تقريبا فوق وأسفل تلك النقاط لإدخال مسامير من شأنها ترسيخ القنية عند وضع الأسمنت للأسنان.
11. اقطع أحد طرفي القسطرة المملوءة مسبقا ب aCSF بمشرط وأدخلها في ذراع زاوية القنية. إصلاح القنية الأولى مع الاسمنت الأسنان. تجنب وضع الأسمنت السني حول الموضع الموجود على القنية الثانية.
12. اترك أسمنت الأسنان يجف لمدة 2-3 دقائق ، ثم قم بإزالة ذراع الحامل من القنية الأولى ، وقم بتثبيت القنية الثانية فيه. كرر الخطوتين 2.11 و 2.12. ضع قنية وهمية على كل من قنيات الدليل. تأكد من أن القنية الوهمية والتوجيه بنفس الطول لمنع تسلل الأنسجة وانسداد القنية.
13. أدخل الطرف الحر لكلتا القسطرة في الجيب الذي تم إجراؤه مسبقا بين لوحي كتف. قم بإزالة المشابك وغرزة الجلد بخيط خياطة 4-0.
    ملاحظه: يجب أن تكون قنية الدليل العلوية متاحة لحقن Aβo القادمة.
14. قم بإزالة من الإطار التجسيمي ووضعه في قفصه. أثناء التعافي بعد الجراحة ، ضع القفص على بطانية مياه التدفئة حتى يستيقظ. يجب أن يكون القفص جزئيا على الوسادة حتى يتمكن الجرذ من الهروب من الحرارة إذا لزم الأمر. راقب باستمرار حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الرق.
15. أعد الفئران إلى منشأة للتعافي من الجراحة لمدة 10 أيام تحت المراقبة الدقيقة.
    ملاحظه: لا تعيد الذي خضع لعملية جراحية إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما. يعطى ميلوكسيكام (1 مجم / كجم) مرة واحدة يوميا لمدة يومين بعد الجراحة لعلاج الألم.

فئة

3. تركيب المضخة التناضحية

1. قبل يوم واحد من التثبيت ، املأ المضخات التناضحية بجسم مضاد 6E10 (1 مجم / مل ؛ 100 ميكرولتر) وتحكم في الجسم المضاد IgG1 (1 مجم / مل ؛ 100 ميكرولتر) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في ظل ظروف معقمة. احتفظ بالمضخات في ماء مقطر معقم عند 37 درجة مئوية طوال الليل لتنشيط المضخات.
2. تخدير الفئران بالأيزوفلوران 3٪ لتركيب مضخات تناضحية (0.5 ميكرولتر / ساعة لمدة 7 أيام). احلق بين لوحي الكتف وقم بتطهير الجلد بمحلول غلوكونات الكلورهيكسيدين 2٪ وكحول الأيزوبروبيل 2٪. قم بعمل شق بطول 2 سم بمشرط بين لوحي الكتف لتحديد موقع قسطرة PE50 المتصلة بقنية التوجيه.
3. قطع نهاية قسطرة PE50 التي تحتوي على أسمنت الأسنان بمشرط. قم بتوصيل المضخات الاسموزية بقسطرة PE50 وأضف بعض الأسمنت السني عند المضخة وتقاطع القسطرة لتأمين الاتصال.
4. غرزة الجلد بإحكام بخيط خياطة 4-0. ضع مرة أخرى في قفصه على وسادة مياه التدفئة. لاحظ أن يستيقظ بسرعة من تخدير الأيزوفلوران (حوالي 5 دقائق).
   ملاحظه: تستغرق الجراحة حوالي 5 إلى 10 دقائق.

< p class = "jove_title" >4. الحقن في الفئران المستيقظة والحركة بحرية

1. تحضير محلول Aβo (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر). اسمح ل Aβo بالتجمع ديناميكيا وتلقائيا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل التسريب.
2. قم بتركيب حقنتين سعة 10 ميكرولتر على مضخة التسريب. املأ المحاقن ب 5 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. قطع قسطرتين من PE50 إلى حوالي 60 سم بطول بمشرط. املأ كلتا القسطرة بالماء المقطر المعقم باستخدام محاقن 1 مل وإبر 21 جرام.
3. احتفظ بالمحاقن سعة 1 مل في أحد طرفي القسطرة وقم بتوصيل الطرف الآخر بمحاقن هاميلتون. قم بإزالة المحاقن سعة 1 مل وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل القسطرة.
4. أدخل القنية الداخلية في نهاية قسطرة PE50. باستخدام الماء المقطر المعقم ، املأ القنية الداخلية المتصلة بقسطرة PE50 حتى 1 ميكرولتر على محاقن هاميلتون. اصنع فقاعة هواء عن طريق سحب المكابس للخلف حتى 2 ميكرولتر.
5. امزج محلول Aβo عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام طرف بحد أدنى من الالتصاق. تجنب تكوين الفقاعات أثناء الخلط. املأ كلا القنيات الداخلية ب 1.5 ميكرولتر من محلول Aβo عن طريق سحب المكابس للخلف حتى 3.5 ميكرولتر.
6. اصنع خطوطا بعلامة قبل وبعد فقاعة الهواء في كلتا القسطرة. هذا بمثابة نقطة تفتيش للتسريب المستمر. للتسريب ، قم بإحضار القفص بالقرب من مضخة التسريب وإزالة غطاءه.
7. ضع الجرذ في تحاضن واكشط ذراع الحنضن بإحكام حول رقبته لشل حركة رأس الفئران. قم بإزالة القنية الوهمية من قنية الدليل. أدخل القنية الداخلية المعدة مسبقا في قنية الدليل. تحقق من إدخالها بالكامل وتثبيتها جيدا على قاعدة قنية التوجيه.
8. حرر الفئران من التحاضن وأعده إلى قفصه للحد من إجهاد الخلاف. راقب عن كثب للتأكد من عدم التواء القسطرة معا وأن التسريب يتم بشكل صحيح.
9. قم بتشغيل مضخة التسريب. حقن 1 ميكرولتر من محلول Aβo بمعدل 0.1 ميكرولتر / دقيقة (10 دقائق). أثناء التسريب ، تأكد من أن مكبس المحقنة يتحرك من 3.5 ميكرولتر إلى 2.5 ميكرولتر وأن فقاعة الهواء في كل من قسطرة PE50 تتحرك باستمرار.
10. اترك القنية الداخلية في مكانها لمدة 5 دقائق أخرى بعد التسريب للسماح بالانتشار الفعال لمحلول Aβo. أعد الجرذ إلى الحضن لإزالة القنية الداخلية وقنية التوجيه المغطاة لمنع ارتجاع المحلول المحقون. استخدم قنية وهمية تتوقف قبل ذراع زاوية القنية مباشرة. أعد إلى قفصه.
11. كرر التسريب مرة واحدة يوميا على مدار 6 أيام متتالية. القتل الرحيم للحيوان بقطع الرأس.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. صورة للحيوان مع قنية ثنائية أثناء التسريب Aβo. تم حقن محلول Aβo (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر ؛ 1 ميكرولتر) في الفئران المستيقظة والحركة بحرية (مرة واحدة يوميا لمدة 6 أيام) باستخدام قسطرة PE50 متصلة بقنية داخلية يتم إدخالها في قنية توجيهية. تم حقن العلاج بالجسم المضاد IgG1 أو 6E10 مباشرة في موقع التسريب Aβo باستخدام مضخات تناضحية تقع تحت الجلد بين لوحي كتف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) جهاز هارفارد 59-7316 PE50 قسطرة جدار رقيق بلاستيك واحد C232CT هيدروكلوريد الكيتامين (100 مجم / مل) بيونيش 1989529 زيلاكسين هيدروكلوريد (100 مجم / مل) بيميدا 8XYL004C ميلوكسيكام (5 ملغ/مل) نوربروك هاتف: 215670I01 محلول غلوكونات الكلورهيكسيدين 2٪ وكحول الأيزوبروبيل 2٪ كيرفيوجن 260100 ج ليدوكائين هيدروكلوريد الفيدا فارما 0122AG01 بوبيفاكائين هيدروكلوريد هوسبيرا 1559 مرهم العيون شركة Baussh and Lomb Inc. 2125706 إطار تجسيمي ستويلتينج 51600 ذراع حامل قنية تجسيمية جهاز هارفارد 72-4837 نقب دريميل 8050-N/18 دليل قنية بلاستيك واحد 326OPG / SPC قنية الحقن بلاستيك واحد C315I / SPC قنية دمية بلاستيك واحد C315DC / SPC خياطة المغلفة الخيط فيكريل رابيد 4-0 إيثيكون في آر 2297 الاسمنت الأكريليك للأسنان جهاز هارفارد 72-6906 البراغي شركة جي موريس P0090CE125 6E10 الجسم المضاد (النمط الإسوي IgG1 للفأر) بيو ليجند 803003 الجسم المضاد للتحكم في النمط المتشافي IgG1 للفأر أبكام AB18447 مضخات التناضح Alzet موديل 1007D شركة Durect 290 إيزوفلوران باكستر CA2L9100 أميلويد بيتا 1-42 rالببتيد أ -1163-1 حقنة هاميلتون (10 ميكرولتر) فيشر ساينتيك 14815279 مضخة حقنة التسريب CMA 402 جهاز هارفارد CMA8003110 حقنة 1 مل دينار بحريني 309659 إبرة 21 جرام تيرومو NN-2125R تكبب لومير بيوميديك RTS04