$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تصنيع المسبار المناعي السعوي ووظائفه
- قم بقص سلك البلاتين المطلي بالبيرفلورو ألكوكسي (PFA) بطول 25 سم (انظر جدول المواد ) وقم بتجريد ما يقرب من 5 مم من طلاء PFA من أحد طرفيه باستخدام مشرط ، مع الحرص على عدم قطع السلك البلاتيني.
- أدخل الطرف المجرد من السلك البلاتيني في دبوس موصل ذكر مطلي بالذهب مقاس 1 مم وقم بتجعيد أسنان دبوس الموصل حول الطرف المجرد من السلك البلاتيني باستخدام كماشة أنف إبرة (انظر جدول المواد).
- لحام السلك البلاتيني بدبوس الموصل المطلي بالذهب. احرص على عدم استخدام كمية زائدة من اللحام.
- تحضير محلول الدوبامين عن طريق إذابة 50 مجم من الدوبامين حمض الهيدروكلوريك في 50 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10 ملي مولار (PBS ، درجة الحموضة 6.0) عن طريق التحريك.
- بمجرد إذابة الدوبامين تماما ، ضع طرف السلك البلاتيني في الوعاء الذي يحتوي على PBS المكمل بالدوبامين الطازج. قم بتوصيل دبوس موصل ذهبي بقناة من المسرح الأمامي (انظر جدول المواد).
- قم بتوصيل قطب قرص كلوريد الفضة (AgCl) (القطب الأرضي ، انظر جدول المواد ) بالقناة الأرضية في المسرح. ضع قرص AgCl في الوعاء الذي يحتوي على PBS مكمل بالدوبامين وسلك بلاتيني ؛ احرص فقط على غمر قطب القرص وليس أي طول للسلك أو اللحام. قم بتوصيل تحويلة سلكية بالقنوات المرجعية للواجهة الأمامية قبل المتابعة.
- افتح برنامج الحصول على البيانات التفاعلي (انظر جدول المواد). قم بإعداد بروتوكول جهد أمر الترسيب الكهربائي لسن المنشار مع المعلمات التالية: بدء الجهد = −0.6 فولت ؛ إمكانات النهاية = +0.65 فولت ؛ معدل المسح = 0.04 فولت∙s-1; مدة الترسيب = 420 ثانية. ابدأ بروتوكول ترسيب البوليدوبامين ، مع التأكد من توصيل جميع الأسلاك بشكل صحيح.
- بعد الانتهاء من ترسيب البوليدوبامين ، قم بإزالة الحبيبات الأرضية AgCl وطرف السلك البلاتيني من الوعاء ، مع الحرص على عدم إزعاج طرف قطب السلك البلاتيني. ضع طرف السلك في أنبوب دقيق يحتوي على PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة 2-5 دقائق أثناء تحضير محلول الجسم المضاد ؛ تأكد من أن طرف السلك لا يلامس جوانب أو أسفل الأنبوب الصغير.
ملاحظة : يمكن صنع محلول الأجسام المضادة أثناء ترسب البوليدوبامين. ومع ذلك ، لا ينبغي تخطي نقل السلك البلاتيني من الوعاء المحتوي على الدوبامين إلى الأنبوب الدقيق ل PBS بعد ترسيب البولي دوبامين.
- تحضير محلول الأجسام المضادة. اجمع بين الجسم المضاد المعني مع PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) بنسبة 1:20 في وعاء بحجم مناسب (على سبيل المثال ، أنبوب دقيق).
ملاحظة : الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للببتيد العصبي Y (المضاد ل NPY) (انظر جدول المواد ) المستخدم هنا تم اقتباسه عند 1 مجم / مل. مثال على تحضير الأجسام المضادة هنا هو 4 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 76 ميكرولتر من PBS.
- انقع الطرف المودع بالبوليدوبامين من القطب البلاتيني في محلول الجسم المضاد لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، مع التأكد مرة أخرى من تعليق طرف السلك البلاتيني في المحلول وعدم الاستلقاء على السطح الداخلي للأنبوب الدقيق.
ملاحظة : فضل التنفيذ الأخير لهذه التقنية استخدام قطب الأسلاك البلاتينية مباشرة بعد هذه الخطوة بدلا من التخزين الرطب أو الجاف لاستخدامه لاحقا.
- بعد النقع في محلول الجسم المضاد ، اشطف لفترة وجيزة طرف المسبار المناعي السعوي الذي يعمل حديثا (مسبار CI) في PBS (درجة الحموضة 7.4). المسبار جاهز الآن للاستخدام.
2. الإعداد التجريبي للكشف في المختبر وقياس الببتيد
- ضع الطرف الوظيفي لمسبار CI في غرفة التدفق ، مع الحرص على عدم إزعاج طرف القطب بأي شكل من الأشكال ، لأن القيام بذلك قد يؤدي إلى إتلاف الطرف الحسي للمسبار.
ملاحظة : تم إنشاء غرفة التدفق عن طريق صب المطاط الصناعي السيليكوني (انظر جدول المواد ) في طبق استزراع 35 مم مع حشو بيضاوي ممدود في وسط الطبق. بعد التصلب ، تتم إزالة الشكل البيضاوي من المطاط الصناعي. ثم يتم دمج الغرفة بمحلول ملحي مخزن في تريس (TBS) ويسمح بمعدل تدفق يبلغ 3 مل / دقيقة. تأكد من أن التدفق الداخل والخارج يحافظان على مستوى السائل في الغرفة بحيث لا يلاحظ أي عمل مد وجزر للصهر الفائق. يجب أن يظل التدفق في مكانه طالما أن مسبار CI قيد الاستخدام.
- قبل الاختبار التجريبي الأول ، قم بإجراء تشغيل معياري TBS لتكييف مسبار CI. قم بإعداد بروتوكول جهد الأوامر التالي: جهد الخطوة الإيجابية = +100 مللي فولت ؛ جهد الخطوة السلبية = −5 مللي فولت ؛ مدة الخطوة = 20 مللي ثانية ؛ مدة الاقتناء = 600 ثانية
ملاحظة : من المهم السماح بتوازن المسبار خلال المرحلة الأولية من إمكانات قيادة ركوب الدراجات قبل الحصول على البيانات.
- قم بإنشاء محلول للببتيد محل الاهتمام باستخدام نفس TBS للحفاظ على تكوين الصحف الفائق. قم بإعداد نظام متعدد حيث يمكن تبديل الصحف الفائق بين TBS و TBS المكمل بالببتيد دون إدخال فقاعات في نظام الأنابيب أو غرفة التدفق.
ملاحظة : تم استخدام الببتيد NPY الخنازير الاصطناعية (انظر جدول المواد }) في هذه الدراسة.
- قم بإعداد بروتوكول الحصول على بيانات استشعار الببتيد باستخدام معلمات TBS القياسية (انظر الخطوة 2.2.).
ملاحظة : في هذا التنفيذ ، كانت مدة كل اختبار تجريبي 360 ثانية (120 ثانية TBS ، 120 ثانية TBS مكملا بالببتيد ، 120 ثانية TBS).