تقنية في المختبر لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في الخلايا العصبية في الحصين

الملخص

المصدر: Chiu ، A. M. ، et al. نهج تغذية الأجسام المضادة لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في ثقافات الحصين الأولية المنفصلة. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو نهجا لتغذية الأجسام المضادة لدراسة تهريب مستقبلات الغلوتامات في الثقافات العصبية الأولية للحصين. يسمح هذا النهج بمراقبة مجموعات المستقبلات في كل من البلازما والأغشية الداخلية. يتم تحقيق التمييز بين هذه المجموعات الفرعية عن طريق تسمية المستقبلات قبل وبعد نفاذية الغشاء ، باستخدام نفس الجسم المضاد الأولي ولكن الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بالفلوروفورات المختلفة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التحضير قبل وضع العلامات

1. تحضير وصيانة ثقافات الحصين الأولية
   1. تحضير مزارع الحصين الأولية بكثافة 150,000 خلية مطلية بغطاء بولي دي ليسين (0.1 مجم / مل) 18 مم. تتوفر أدلة ممتازة لإعداد ثقافة الخلايا العصبية المنفصلة.
      ملاحظه: إذا لزم الأمر ، يمكن معالجة الثقافات بالسيتوزين أرابينوسيد (Ara-C ، 10 ميكرومتر من أيام في المختبر 1 [DIV1]) لتجنب تكاثر الدبق في المستحضر.
      ملاحظه: يمكن استخدام كواشف الطلاء البديلة مثل الفيبرونيكتين (1 مجم / مل) أو اللامينين (5 ميكروغرام / مل) بدلا من بولي دي ليسين.
   2. الحفاظ على المزارع في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في 2 مل / بئر من الوسائط القاعدية العصبية المكملة ب B27 و 2 ملي مولار L-glutamine.
      ملاحظه: يمكن استخدام بدائل L-glutamine (على سبيل المثال ، Glutamax) ، إذا رغبت في ذلك.
   3. على أساس أسبوعي ، قم بإزالة نصف حجم الوسائط واستبدلها بنفس الحجم من الوسائط العصبية العصبية الكاملة.
2. اختياري: تعداء المستقبلات المتحولة و / أو الموسومة بالحاتمة
   ملاحظة: يجب نقل الخلايا العصبية قبل 3-4 أيام على الأقل من النقطة الزمنية للتحليل للسماح بالتعبير عن المستقبلات. يؤدي استخدام الخلايا العصبية الشابة (DIV6-9) إلى كفاءة تعداء أفضل من الخلايا العصبية القديمة (DIV15-20) ، ولكن يمكن تحقيق عدد كاف من الخلايا المنقولة (>20) بغض النظر عن DIV المستخدم.
   1. لكل بئر من صفيحة 12 بئرا ، قم بتخفيف 1.5 ميكروغرام من البلازميد الذي يحتوي على بنية ذات أهمية في 100 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية الطازجة بدون B27 أو مكملات الجلوتامين في أنبوب طرد مركزي دقيق واخلطه عن طريق الدوامة بسرعة.
      ملاحظه: من أجل التعداء الناجح ، من الأهمية بمكان أن تكون الوسائط العصبية القاعدية المستخدمة طازجة قدر الإمكان ، من الناحية المثالية أقل من أسبوع واحد بعد فتح الزجاجة.
   2. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الثاني ، امزج 1 ميكرولتر من كاشف شفت الدهون المناسب في 100 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية الطازجة واخلطها برفق.
      ملاحظه: لا تقم بدوامة خليط كاشف شفق الدهون. يمكن أن يؤدي استخدام كواشف شفط الدهون الطازجة إلى تحسين كفاءة التعداد.
   3. احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
   4. يضاف خليط كاشف شفق الدهون بالتنقيط إلى خليط الحمض النووي ، ويخلط برفق ، ويحتضن لمدة 20 دقيقة في RT.
   5. اضبط حجم الوسائط في كل بئر على 1 مل من الوسائط المكيفة.
   6. أضف كاشف الدهون - خليط الحمض النووي بالتنقيط إلى البئر.
   7. أعد الخلايا إلى الحاضنة واترك ما لا يقل عن 3-4 أيام للتعبير عن البروتين.
      ملاحظه: لأغراض بروتوكولات الاستيعاب وإعادة التدوير الموضحة أدناه ، تم نقل الخلايا العصبية في الحصين في DIV11-12 مع تركيبات تعبر عن GluN2B الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) في المجال خارج الخلية (GFP-GluN2B) وتم تصويرها في DIV15-16.
3. اختياري: حضانة الخلايا بالأدوية (بشكل مزمن أو حاد) في الوسائط المكيفة حتى التثبيت.< / > ملاحظة: للعلاج الحاد ، ابدأ في معالجة الخلايا قبل وضع الملصقات. اعتمادا على بروتوكول العلاج الدوائي المستخدم ، يمكن الحفاظ على الخلايا في وسائط تحتوي على المخدرات خلال القسم 2. في مثالنا ، خضعت خلايا DIV21 لبروتوكول التقوية طويلة المدى (cLTP) المستحث كيميائيا لزيادة مستقبلات حمض α-أمينو-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-إيزوكسازول بروبيونيك (AMPAR) المعبر عنها على السطح.
   1. تبادل الوسائط المشروطة بالمحلول خارج الخلية (ECS).
   2. عالج الخلايا ب 300 ميكرومتر جلايسين في ECS لمدة 3 دقائق في RT. كعنصر تحكم ، عالج غطاء شقيق باستخدام ECS (بدون جلايسين).
   3. اغسل الخلايا 3 مرات مع 37 درجة مئوية ECS وأعد الخلايا في ECS (بدون جلايسين) إلى حاضنة الخلية لمدة 20 دقيقة قبل الاستمرار في القسم 2.
      ملاحظة: ECS (بالملليمتر): 150 كلوريد الصوديوم ، 2 كلوريد_{المكالسيوم 2} ، 5 كيلو كلوريد ، 10 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينات إيثان سلفونيك حمض (HEPES) ، 30 جلوكوز ، 0.001 توكسين رباعي الجذور (TTX) ، 0.01 ستركنين ، و 0.03 بيكروتوكسين عند درجة الحموضة 7.4.

< p class = "jove_title" >2. وضع العلامات الحية للمستقبلات المعبر عنها على السطح

1. تحضير أغطية لوضع العلامات
   1. لحفظ الكواشف وتسهيل التلاعب ، قم بنقل جانب الخلية إلى صينية مغطاة بفيلم البارافين.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان عدم ترك العينات تجف أبدا.
   2. حفظ وصيانة الوسائط المكيفة عند 37 درجة مئوية لخطوات الحضانة والغسيل.
      ملاحظه: بالنسبة للغطاء 18 مم ، يوصى بالحضانة مع 75-100 ميكرولتر من الوسائط لوضع العلامات على الأجسام المضادة و 120-150 ميكرولتر للاستيعاب / إعادة التدوير.
2. وضع العلامات على المستقبلات السطحية بالجسم المضاد الأولي
   1. احتضان الخلايا بجسم مضاد أولي مخفف في وسائط مكيفة لمدة 15 دقيقة في RT.
      ملاحظه: بالنسبة للمستقبلات الموسومة ب GFP ، تم استخدام الجسم المضاد للأرانب المضاد ل GFP عند تخفيف 1: 1000. بالنسبة ل GluA1 الداخلي ، تم استخدام الفأر المضاد ل GluA1 عند تخفيف 1: 200.
   2. اسحب بعناية من الوسائط المحتوية على الأجسام المضادة باستخدام ماصة مفرغة واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام وسائط مكيفة.
      ملاحظه: إذا كانت الوسائط المكيفة غير متوفرة ، فيمكن تنفيذ جميع خطوات الغسيل باستخدام PBS + [محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 1 ملي مولار MgCl₂ و 0.1 ملي CaCl₂]. يمكن إجراء الشفط اليدوي باستخدام ماصة دقيقة في حالة عدم توفر الشفط الفراغي اللطيف.

< p class = "jove_title" >3. التعبير السطحي (الشكل 1)

1. وضع العلامات الثانوية على الأجسام المضادة للمستقبلات المعبر عنها على السطح
   1. اغسل مرة واحدة باستخدام PBS +.
   2. قم بإصلاح الخلايا عن طريق احتضان 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) و 4٪ سكروز في PBS لمدة 7-8 دقائق
      ملاحظه: على عكس طرق التثبيت الأخرى مثل حضانة الميثانول ، فإن PFA لا يتخلل غشاء البلازما وبالتالي فهو مناسب لتحليل التعبير السطحي. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم PFA المحضر حديثا. التخزين قصير الأجل ل PFA عند 4 درجات مئوية أو التخزين طويل الأجل (حتى 30 يوما) عند -20 درجة مئوية مسموح به للتثبيت المناسب.
      أنذر: PFA مادة مسرطنة معروفة. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء الأمان عند المناولة.
   3. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.
      العادي ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام 0.1 M glycine لغسل PFA بدلا من PBS ، حيث أن الجلايسين سوف يروي أي مثبت متبقي قد يزيد من الخلفية في المستحضر.
   4. قم بحظر مواقع الربط غير المحددة عن طريق الحضانة بمصل الماعز العادي بنسبة 10٪ (NGS) في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
      ملاحظه: يمكن تمديد وقت الحظر دون آثار ضارة على وضع العلامات.
   5. احتضان الجسم المضاد الثانوي الموسوم بالفلورسنت المخفف في 3٪ NGS في PBS لمدة ساعة واحدة في RT لتسمية المستقبلات الأولية المسماة بالأجسام المضادة (أي عبر عنها على السطح).
      ملاحظه: في هذه الأمثلة ، تم استخدام تخفيف 1: 500 من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع Alexa 555: مضاد للأرانب للماعز للمستقبلات المسماة GFP ومضاد للماعز للفأر ل GluA1.
   6. اغسل الخلايا باستخدام PBS 3x.
2. وضع العلامات على المستقبلات داخل الخلايا
   1. تخلل الخلايا بنسبة 0.25٪ Triton X-100 في PBS لمدة 5-10 دقائق عند RT.
      ملاحظه: للتحقق من أن الجولة الأولى من وضع العلامات على الأجسام المضادة تشغل جميع الحلقات السطحية ، يمكن تخطي خطوة النفاذية هذه في ثقافة شقيقة. في هذه الحالة ، لا ينبغي الحصول على إشارة للمستقبلات داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، للتحقق من عدم تصنيف أي مستقبلات داخلية في القسم السابق 2 (أي إظهار سلامة أغشية البلازما في المزرعة) ، يمكن تخطي خطوة النفاذية في ثقافة شقيقة ، ويمكن استخدام جسم مضاد أساسي ضد بروتين داخل الخلايا (على سبيل المثال ، بروتين كثافة ما بعد المشبكي 95 [PSD-95] أو البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 [MAP2]) في الخطوة 2.2.1. لا ينبغي الحصول على أي إشارة من هذا الأساسي في ظل هذه الظروف. في هذه الحالة ، تم استخدام جسم مضاد للأرانب مضاد ل PSD-95 (1: 500).
   2. قم بالحظر باستخدام 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
   3. قم بتسمية المستقبلات داخل الخلايا عن طريق احتضان الخلايا المنفذة بنفس الجسم المضاد الأساسي المستخدم في القسم 2.2 المخفف في 3٪ NGS في PBS لمدة ساعة واحدة في RT.
      ملاحظه: قد يكون تخفيف الأجسام المضادة لوضع العلامات على المستقبلات داخل الخلايا مختلفا عن ذلك المطلوب لوضع العلامات على المستقبلات المعبر عنها على السطح. في مثال GluA1 ، تم استخدام نفس تخفيف الجسم المضاد (1: 200).
   4. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS.
   5. ملصق بجسم مضاد ثانوي ثان موسوم بالفلورسنت مخفف بنسبة 3٪ NGS في PBS لمدة ساعة واحدة عند RT.
      ملاحظه: في هذه الأمثلة ، تم استخدام تخفيف 1: 500 من الجسم المضاد الثانوي المترافق للماعز المضاد للفأر Alexa 647 (ل GluA1).
   6. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS.

< p class = "jove_title" >4. الاستيعاب (الشكل 2)

1. استيعاب المستقبلات السطحية المسماة بالأجسام المضادة
   1. بعد وضع العلامات على المستقبلات المعبر عنها على السطح وغسل الأجسام المضادة (القسم 2.2) ، احتفظ بالخلايا في وسائط مكيفة بدون جسم مضاد وأعدها إلى الحاضنة (37 درجة مئوية) للسماح بالاستيعاب.
      ملاحظة: بالنسبة لمستقبلات N-methyl-D-aspartate (NMDA) ، يوصى ب 30 دقيقة للاستيعاب. كعنصر تحكم ، يمكن الحفاظ على الثقافة الشقيقة باستخدام وسائط مكيفة عند 4 درجات مئوية أثناء عملية الاستيعاب. يجب أن يحدث الحد الأدنى من استيعاب المستقبلات في ظل هذه الظروف.
2. وضع العلامات على المستقبلات السطحية
   1. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS +.
   2. قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 4٪ PFA و 4٪ سكروز في PBS لمدة 7-8 دقائق
      أنذر: استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء الأمان عند التعامل مع PFA.
   3. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS العادي.
   4. قم بالحظر باستخدام 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة عند RT لمنع الارتباط غير المحدد.
   5. احتضان العينات بجسم مضاد ثانوي موسومات بالفلورسنت مخفف في 3٪ NGS في PBS لمدة ساعة واحدة في RT لتسمية المستقبلات الأولية المسماة بالأجسام المضادة (أي المستقبلات المعبر عنها على السطح والتي لم يتم استيعابها).
      ملاحظه: في هذا المثال ، تم استخدام الجسم المضاد الثانوي للماعز المترافق Alexa 555 (1: 500) لوضع العلامات.
   6. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS.
3. وضع العلامات على المستقبلات الداخلية
   1. تخلل الخلايا بنسبة 0.25٪ Triton X-100 في PBS لمدة 5-10 دقائق.
   2. قم بحظر الارتباط غير المحدد عن طريق الحضانة باستخدام 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
   3. احتضان العينات بجسم مضاد ثانوي موسومات بالفلورسنت مخفف في 3٪ NGS في PBS لمدة ساعة واحدة في RT لتسمية المستقبلات الداخلية المسماة بالأجسام المضادة.
      ملاحظه: في هذا المثال ، يتم استخدام الجسم المضاد الثانوي للماعز المترافق Alexa 647 (1: 500) لوضع العلامات.
   4. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS.

< p class = "jove_title" >5. إعادة التدوير (الشكل 3)

1. استيعاب المستقبلات السطحية المسماة بالأجسام المضادة
   1. بعد وضع العلامات على المستقبلات المعبر عنها على السطح وغسل الأجسام المضادة (القسم 2.2) ، احتفظ بالخلايا في وسائط مكيفة بدون جسم مضاد وأعدها إلى الحاضنة (37 درجة مئوية) للسماح بالاستيعاب.
      ملاحظة: بالنسبة لمستقبلات NMDA ، يوصى ب 30 دقيقة للاستيعاب.
2. حجب المستقبلات المعبر عنها السطحية المستقرة
   1. لمنع الحلقات الموجودة على الجسم المضاد الأولي المتصل بالمستقبلات المعبر عنها على السطح والتي لم يتم استيعابها ، قم باحتضان الخلايا بشظايا الأجسام المضادة المضادة ل Fab المضادة ل IgG (H + L) غير المترافقة (ضد الابتدائية المستخدمة في القسم 2.2) المخففة في وسائط مكيفة (20 ميكروغرام / مل) لمدة 20 دقيقة في RT. يمنع هذا العلاج التفاعل المستقبلي مع الأجسام المضادة الثانوية.
      ملاحظه: في هذا المثال ، تم استخدام شظايا الماعز المضادة للأرانب.
      ملاحظه: تجربة التحكم: لضمان حدوث انسداد كامل للمستقبلات المعبر عنها على السطح ، يمكن احتضان الأغطية الشقيقة مع وبدون Fab. يجب إصلاح الثقافات مباشرة بعد علاج Fab ، ويتم تحضين كلتا المزرعتين بجسم مضاد ثانوي مترافق ب Alexa 555. لا توجد إشارة Alexa 555 في الخلايا المحتضنة Fab تشير إلى حجب الأجسام المضادة المناسبة.
   2. اغسل الخلايا 3 مرات بوسائط مكيفة.
   3. احتضان الخلايا بوسائط مكيفة تحتوي على 80 ميكرومتر دينازور لمنع المزيد من الاستيعاب وإعادة الخلايا إلى الحاضنة (37 درجة مئوية) للسماح بإعادة تدوير المستقبلات الداخلية. Dynasore هو مثبط GTPase يثبط الدينامين وبالتالي يمنع الاستيعاب.
      ملاحظة: يوصى ب 45 دقيقة لإعادة تدوير NMDAR. لاحظ أن Dynasore يمنع حصريا عملية الاستيعاب المعتمدة على الدينامينة (على سبيل المثال ، استيعاب NMDARs). ومع ذلك ، لا يزال من الممكن أن يحدث استيعاب البروتين المشبكي الآخر (المستقل عن الدينامين) في وجود Dynasore.
3. وضع العلامات على المستقبلات المعاد تدويرها
   1. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS +.
   2. قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 4٪ PFA و 4٪ سكروز في PBS لمدة 7-8 دقائق
      أنذر: استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء الأمان عند التعامل مع PFA.
   3. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS.
   4. قم بالحظر باستخدام 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة عند RT لمنع الارتباط غير المحدد.
   5. قم بتسمية الخلايا ذات أول جسم مضاد ثانوي موسومات بالفلورسنت مخفف في 3٪ NGS في PBS لمدة ساعة واحدة في RT.
      ملاحظه: في هذا المثال ، تم استخدام الجسم المضاد للماعز المترافق Alexa 555 (1: 500) لوضع العلامات.
   6. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS.
      ملاحظه: قد تساعد الغسالات الأطول باستخدام PBS (5-10 دقائق) في تقليل الخلفية في التحضير.
4. وضع العلامات على المستقبلات الداخلية
   1. تخلل الخلايا بنسبة 0.25٪ Triton X-100 في PBS لمدة 5-10 دقائق.
   2. قم بالحظر باستخدام 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
   3. ملصق بجسم مضاد ثانوي ثان موسوم بالفلورسنت مخفف بنسبة 3٪ NGS في PBS لمدة ساعة واحدة عند RT.
      ملاحظه: في هذا المثال ، تم استخدام الجسم المضاد للماعز المترافق Alexa 647 (1: 500) لوضع العلامات.
   4. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS.

< p class = "jove_title" >6. تركيب وتصوير العينات

1. قم بتركيب الخلايا عن طريق وضع جانب الخلية برفق على 12-15 ميكرولتر من وسائط التثبيت المناسبة.
   ملاحظه: سيؤدي التطلع إلى وسائط التركيب الزائدة إلى تحسين جودة الصور.
2. صور الخلايا على مجهر متحد البؤر مناسب.
   ملاحظه: يوصى بتصوير مكدس z بتكبير 60x بخطوات 0.35 ميكرومتر ، تشمل سمك الخلايا العصبية بالكامل.

7. اعتبارات الوقت

1. هذا بروتوكول طويل يمكن إيقافه عند عدة نقاط. إذا رغبت في ذلك ، قم بإجراء خطوات حضانة الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
2. بدلا من ذلك ، إذا رغبت في ذلك ، استخدم معالج مناديل الميكروويف لتسريع أوقات حضانة ما بعد التثبيت بشكل كبير. لجميع الخطوات، استخدم 150 واط عند 30 درجة مئوية لإعدادات "التشغيل".​
   1. للحظر ، قم بتشغيل المعالج عند دقيقتين "تشغيل" و 1 دقيقة "إيقاف" و 2 دقيقة "تشغيل".
   2. بالنسبة لخطوات حضانة الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، قم بتشغيل المعالج عند 3 دقائق "تشغيل" و 2 دقيقة "إيقاف" و 3 دقائق "تشغيل"
      ملاحظة: لا نلاحظ أي اختلاف في الجودة من خلال إجراء التعديلات المذكورة أعلاه على البروتوكول.

< p class = "jove_title" >8. تحليل الصور

يوصى
1. باستخدام فيجي لإجراء تحليل الصور ، لأنه متوافق مع تنسيقات ملفات متعددة. بالنسبة لبياناتنا ، تم الحصول على صور بتنسيق ملف Nikon ND2.
2. يتم توفير نص كلي لسهولة القياس الكمي للدفعات لمختلف المعلمات التي تم اختيارها مسبقا من قبل FIJI. يتم تضمين الخطوات التالية في الماكرو:
   ملاحظة: في هذه الأمثلة ، تم قياس "الكثافة المتكاملة".
3. افتح ملفات الصور في فيجي وقنوات منفصلة.
4. Z-projects كل مكدس قناة كإسقاط أقصى كثافة.
5. قم بتعيين حد أدنى لكل قناة.
   ملاحظة: ينبغي تحديد العتبات تجريبيا لكل مجموعة بيانات تجريبية. في حين أن كل قناة يمكن أن يكون لها قيمة عتبة أقل منفصلة ، فمن الأهمية بمكان الحفاظ على قيم عتبة القناة باستمرار لجميع صور مجموعة البيانات نفسها.
6. حدد ثلاثة إلى خمسة تشعبات ثانوية أو ثالثة واحفظها كمناطق ذات اهتمام (ROIs).
7. قياس الكثافة المتكاملة لكل عائد استثمار في القنوات السطحية وداخل الخلايا.
8. تطبيع الإشارة لكل عائد استثمار بقسمة قيمة الكثافة المتكاملة للقناة السطحية على القناة داخل الخلايا.
9. كرر القياسات لجميع الصور التجريبية والتجريبية وقم بتطبيع القيم التجريبية للتحكم في القيم (على سبيل المثال ، GluN2B WT أو ظروف عدم الجلايسين).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: يزيد cLTP من التعبير السطحي ل GluA1. تعرضت الخلايا العصبية الأولية للحصين في DIV21 لمادة LTP الكيميائية (cLTP) عن طريق الحضانة باستخدام ECS المحتوية على الجلايسين. يكشف وضع العلامات المميزة على مجموعات GluA1 المعبر عنها على السطح (الأحمر) مقابل داخل الخلايا (الأزرق) عن الزيادة المتوقعة في التعبير السطحي ل AMPAR. (أ) صور متحدة البؤر أحادية المستوى و (ب

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 18 مم قطر # 1.5 غطاء سميك نيوفيترو جي 181.5 Alexa 555 الماعز المترافق المضاد للفأر الثانوي تقنيات الحياة أ 21424 Alexa 555 مترافق الماعز المضاد للأرانب الثانوية تقنيات الحياة أ 21429 Alexa 647 الماعز المترافق المضاد للفأر الثانوي تقنيات الحياة أ21236 Alexa 647 الماعز المترافق المضاد للأرانب الثانوية تقنيات الحياة أ21245 ب 27 جيبكو 17504044 كلوريد_{الهواء 2} سيغما [ك7902] لوحات زراعة الخلايا المسطحة ذات القاع المسطح من Corning Costar كورنينج 3513 ديناسور توكرس 2897 الجلوكوز سيغما G8270 جلايسين توكرس 219 شظايا الماعز المضادة للأرانب فاب سيغما SAB3700970 هيبس سيغما H7006 كيه سي إل سيغما ص 9541 ل-جلوتامين سيغما جي 7513 ليبوفيكتامين 2000 إنفيتروجين 11668019 الجسم المضاد للفأر المضاد ل GluA1 ميليبور MAB2263 كلوريد الصوديوم سيغما الطراز S6546 الوسائط العصبية القاعدية جيبكو 21103049 NGS أبكام أب7481 بارافيلم بيميس PM999 برنامج تلفزيوني جيبكو 10010023 بيلكو بيويف تيد بيلا 36500 PFA ألفا إيسار هاتف: 43368 بيكروتوكسين توكرس 1128 بولي د-ليسين هيدروبروميد سيغما P7280 ProLong Gold Antifade Mountant تقنيات الحياة ص36934 الأرانب المضادة للجسم المضاد ل GFP إنفيتروجين أ 11122 الأرانب المضادة للجسم المضاد PSD-95 إشارات الخلية 2507 الاستركنين توكرس 2785 سكروز سيغما S0389 شرائح مجهر Superfrost plus صياد 12-550-15 تريتون X-100 سيغما X100 تي تي إكس توكرس 1078