اختبار في المختبر لقياس البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة بواسطة الخلايا البلعمية

الملخص

المصدر: Powell، R.L.، et al. عزل الكريات البيض من حليب الثدي البشري لاستخدامه في فحص البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لأهداف فيروس نقص المناعة البشرية. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو فحصا لقياس البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP) بواسطة الخلايا البلعمية لبن الثدي. يتم دمج الكريات المجهرية ذات العلامات الفلورية المقترنة بمركب الأجسام المضادة للمستضد ، مع معلق خلوي معزول من حليب الثدي للحث على البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة بواسطة الكريات البيض البلعمة. عند تسمية الخلايا بالأجسام المضادة ضد مستضد الكريات البيض الشائعة (CD45) ، يتم استخدام قياس التدفق الخلوي لقياس شدة التألق للكريات البيض البلعمية القابلة للحياة الإيجابية للكرة المجهرية ، مما يشير إلى مستوى نشاط ADCP.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. إعداد الكرة المجهرية المستهدفة

1. حدد مستضد مستهدف ذي صلة.
   ملاحظه: في هذا المثال ، تم استخدام البروتين المؤتلف V1V2-2F5K ، والذي تم تصميمه لتقليد القمة الثلاثية لمغلف فيروس نقص المناعة البشرية الأصلي.
2. قم بإجراء البيوتينيل باستخدام مجموعة تجارية (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   1. احسب مليمول من كاشف البيوتين لإضافته إلى التفاعل للحصول على فائض مولي بمقدار 5 أضعاف باستخدام الصيغة: بيوتين ممول = بروتين مل × (بروتين ملغ / ملي بروتين) × (مليمول بيوتين / بروتين مللي) × (5 مليمول بيوتين / بروتين مليمول). ثم احسب ميكرولتر من كاشف البيوتين المراد إضافته باستخدام الصيغة: ميكرولتر بيوتين = مليمول بيوتين × (1،000،000 ميكرولتر / لتر) × (لتر / 10 مليمول).
   2. قم بموازنة البيوتين مع درجة حرارة الغرفة قبل الفتح. قم بإذابة البروتين في 0.5-2.0 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) وفقا للحساب الذي تم إجراؤه أعلاه.
   3. قم بإعداد محلول 10 ملي مولار من كاشف البيوتين في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وأضف الحجم المناسب من كاشف البيوتين 10 ملي مولار إلى محلول البروتين ، واحتضان التفاعل على الجليد لمدة ساعتين أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
3. إزالة البيوتين الزائد باستخدام مكثفات البروتين (أغشية البولي إيثر سلفون [PES] ، قطع الوزن الجزيئي 3 كيلو دالتون [MWCO] ، 0.5 مل ؛ جدول المواد) حسب تعليمات الشركة المصنعة.
   1. قم بإيداع العينة في الغرفة العلوية لعمود الدوران وأضف PBS حتى 400 ميكرولتر. جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
   2. تخلص من التدفق وأضف PBS إلى 400 ميكرولتر. كرر الطرد المركزي. تخلص من التدفق وأضف PBS إلى 100 ميكرولتر. قم بقياس تركيز البروتين بواسطة مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظه: يمكن تقطيع البروتين وتجميده عند -80 درجة مئوية حتى استخدامه.

فئة

2. تحضير لوحة فحص البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP)

1. اقتران البروتين الحيوي إلى 1 ميكرومتر مجهرية ("الخرز" ؛ جدول المواد) حسب تعليمات الشركة المصنعة.
   1. لكل طبق من الخرز المترافق ، احتضن 6 ميكروغرام من البروتين مع 12 ميكرولتر من حبات المرق في 200 ميكرولتر من 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) -PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، مع الدوران برفق كل 20 دقيقة.
   2. جهاز طرد مركزي عند 13,000 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، ودوامة برفق وأعد تعليقها في 1200 ميكرولتر من 0.1٪ BSA-PBS. كرر الدوران وغسل الخطوة 2x. قم بالتعليق في 1200 ميكرولتر من 0.1٪ BSA-PBS.
2. Aliquot 10 ميكرولتر من محلول الخرزة لكل بئر في صفيحة مستديرة القاع 96 بئر. تحضير تخفيفات الأجسام المضادة أو الأمصال المناعية ذات الأهمية في 12 ميكرولتر من 2٪ HSA HBSS ، وعادة ما تبدأ من 50 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد أو تخفيف المصل 1/100.
   ملاحظه: في بيانات العينة ، تم استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة (mAb) 830A.
3. أضف 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة / المصل المعير إلى صفيحة الخرزة واحتضانها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. أضف 200 ميكرولتر من 2٪ HSA HBSS إلى كل بئر ولوحة طرد مركزي عند 2,000 × جم لمدة 10 دقائق.
4. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الانقلاب السريع وصب السائل من آبار الألواح في الحوض لتجنب إزعاج حبيبات الخرزة غير المرئية.

< p class = "jove_title" >3. عزل خلايا حليب الثدي

1. الحصول على حليب الثدي البشري من النساء المرضعات الأصحاء، مع شفط عنه باستخدام مضخات إلكترونية أو يدوية مزدوجة. عزل الخلايا في غضون ~ 4 ساعات من التعبير ، مع الحفاظ على الحليب في درجة حرارة الغرفة.
2. باستخدام أنابيب سعة 50 مل ، قم بجهاز طرد مركزي 50 مل من الحليب بوزن 800 × جم لمدة 15 دقيقة. امسح الجزء الداخلي من الأنبوب بمنديل خال من النسالة لإزالة كل الدهون من جدار الأنبوب.
3. أضف 10 مل من زلال المصل البشري بنسبة 2٪ في محلول الملح المتوازن من هانك (2٪ HSA HBSS [بدون Ca²⁺ أو Mg ⁺]). أعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينة اللطيف لتجنب تنشيط الخلايا وموت الخلايا المبرمج. انقله إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 10 دقائق.
4. اسكب المادة الطافية وكرر الخطوة 1.3. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا برفق في 1-2 مل من 2٪ HSA HBSS اعتمادا على عدد الخلية المتوقع ، وعد الخلايا بواسطة مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي ، مع ملاحظة أيضا صلاحية الخلية.

< p class="jove_title">4. مقايسة ADCP

ملاحظة: الطرق الموضحة هنا مقتبسة من Ackerman et al.

1. أضف 50,000 خلية BM معزولة حديثا إلى كل لوحة فحص ADCP جيدا في 200 ميكرولتر من 2٪ HSA-HBSS. احتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
   1. بالنسبة لتجارب التحكم ، قم باحتضان الخلايا مسبقا عند 37 درجة مئوية باستخدام مثبط أكتين 10 ميكروغرام / مل (السيتوكالاسين-D) ، أو 50 ميكروغرام / مل عامل حجب مستقبلات Fc (FcBlock) ، أو مزيج من الاثنين قبل إضافتهما إلى اللوحات.
2. لوحة الطرد المركزي عند 930 × جم لمدة 10 دقائق. أضف 200 ميكرولتر من 2٪ HSA HBSS وكرر الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية بعناية كما في الخطوة 2.7 وكرر الغسيل.
3. قم بإزالة الخلايا الطافية والبقع بعناية من أجل البقاء باستخدام 0.5 ميكروغرام / مل (التركيز النهائي) بقعة قابلة للإصلاح 450 لكل بئر في 50 ميكرولتر من 2٪ HSA HBSS. احتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لوحة الطرد المركزي عند 930 × جم لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية كما في الخطوة 2.7. أضف 200 ميكرولتر من 2٪ HSA HBSS ولوحة الطرد المركزي مرة أخرى متبوعة بإزالة المادة الطافية كما في الخطوة 2.7.
4. بعد تلطيخ الجدوى ، قم بتلطيخ الخلايا لعلامات الكريات البيض ذات الأهمية ، بما في ذلك الحد الأدنى من وصمة عار خاصة ب CD45 مثل PE-mouse المضاد للإنسان CD45 (استنساخ HI30) بتركيز محسن (1 ميكروغرام / ميكرولتر في 50 ميكرولتر من 1٪ BSA HBSS في بيانات المثال).
   ملاحظه: يمكن تضمين أي علامات ذات أهمية خاصة بالنسب.
5. احتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لوحة الطرد المركزي عند 930 × جم لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية كما في الخطوة 2.7. أضف 200 ميكرولتر من 1٪ BSA HBSS وكرر الطرد المركزي. إزالة المادة الطافية. قم بتثبيت الخلايا في 200 ميكرولتر من 0.5٪ فورمالديهايد في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_title" >5. التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي

1. قم بإجراء بوابة أولية للتخلص من المضاعفات على مخطط الانتثار الأمامي (FSC) مقابل الانتثر الجانبي (SSC) والحطام (مادة أصغر من FSC = 5000) (انظر الشكل 1). استخدم مؤامرة SSC مقابل بقعة البقاء (V450 في هذه الحالة) للقضاء على الخلايا الميتة (تلك الإيجابية لبقعة البقاء).
2. استخدم مخطط SSC مقابل CD45 للتمييز بين فئات الكريات البيض الرئيسية (الخلايا الحبيبية ، الخلايا الوحيدة ، الخلايا الليمفاوية) كما هو موضح على نطاق واسع.
   ملاحظه: هذا التصنيف موحي فقط وهناك حاجة إلى علامات خاصة بالنسب لتأكيد نوع الخلية.
3. بالنسبة لجميع خلايا CD45 + ، أو لكل مجموعة فرعية من الكريات البيض ذات الأهمية ، قم بقياس نشاط ADCP عن طريق البوابات بعلامة على الخلايا موجبة الخرزة في رسم بياني لقناة إيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC) ، حيث يتم اكتشاف حبات الفلورسنت.
   ملاحظه: ستشير آبار التحكم السلبية التي لم تتم إضافة الخرزات فيها إلى مكان ظهور الخلايا الموجبة للحبة في الرسم البياني وبالتالي مكان وضع علامة البوابة.
4. احسب درجات ADCP على أنها (متوسط شدة التألق [MFI] للخلايا الإيجابية للحبة) x (٪ من إجمالي خلايا CD45 + في المجموعة الإيجابية). استخدم برامج الرسومات لرسم الدرجات عند كل تركيز Ab / مصل وإجراء تحليل منطقة تحت المنحنى (AUC><). ملاحظه: يعتبر ADCP إيجابيا إذا كان AUC أكبر من 3x الانحراف المعياري لدرجة ADCP AUC لعنصر تحكم سلبي غير محدد mAb (في هذه الحالة ، 3865).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: عينة بيانات قياس التدفق الخلوي للخلايا المعزولة من حليب الثدي. تمت معالجة الخلايا وتلطيخها كما هو موضح في البروتوكول. (أ) تم إغلاق الخلايا المفردة للقضاء على الزوجي في مخطط FSC-H مقابل FSC-A كما هو موضح ، كما تم إخراج الحطام الصغير <5,000 في FSC-A. (ب) تم استخدام هذه المجموعة للبوابة على الخلايا الحية (التي لا تلطخ بصبغة البقاء) في مخطط SSC مقا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1 ميكرومتر FluoSpheres NeutrAvidin-Label المجهرية ثيرمو فيشر F8776 BD Pharmingen PE ماوس مضاد للإنسان CD45 دينار بحريني 560975 مصل الأبقار الألبومين MP الطب الحيوي 8810025 كورنينج فول بوليسترين 96 بئر صفيحة كورنينج 3894 السيتوكالاسين د سيغما هاتف: 22144-77-0 طقم EZ-Link NHS-LC-LC-BIOTIN ثيرمو فيشر هاتف: 21338 Falcon 15mL أنابيب الطرد المركزي المخروطية كورنينج 352196 Falcon 50mL أنابيب الطرد المركزي المخروطية كورنينج 352070 بقعة قابلة للإصلاح 450 دينار بحريني 562247 محلول الفورمالديهايد سيغما 252549 HBSS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم أو الفينول الأحمر تقنيات الحياة 14175-095 كتلة BD Fc البشرية دينار بحريني 564219 مصل البشري الألبومين MP الطب الحيوي 2191349 Kimtech Science Kimwipes ممسحات المهام الحساسة كيمبرلي كلارك بروفيشنال 34120 PBS 1x درجة الحموضة 7.4 ثيرمو فيشر 10010023 البوليسترين 10 مل ماصات مصلية كورنينج 4488 مكثفات البروتين PES، 3K MWCO، 0.5 مل ثقب 88512