تقييم تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية باستخدام صبغة مؤشر الكالسيوم

الملخص

المصدر: Perrenoud، L. et al. ، تحليل تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية في الخلايا التائية الأولية للفئران عن طريق قياس التدفق الخلوي الكامل للطيف.J. Vis. Exp. (2022)

يحلل هذا الفيديو تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية في الخلايا التائية. تعمل الأجسام المضادة المضادة ل CD3 على تنشيط مسارات إشارات الخلايا التائية ، مما يؤدي إلى زيادة أيونات الكالسيوم داخل الخلايا التي ترتبط بصبغة Indo-1. في قياس التدفق الخلوي ، يرتبط تحول الطيف من الحالة الخالية من الكالسيوم إلى الحالة المرتبطة بالكالسيوم بتدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلايا المناعية من طحال الفأر

ملاحظة: القتل الرحيم للفئران الساذجة بثاني أكسيد الكربون (CO₂). تستخدم الفئران C57BL / 6 التي تم شراؤها من مختبرات جاكسون وتربيتها داخليا للتجارب في عمر 6-12 أسبوعا. يتم استخدام كل من الفئران من الذكور والإناث للتجارب.

1. تطهير جلد الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول لتقليل احتمالية دخول الملوثات الخارجية إلى العينة.
2. قم بتشريح طحال الفأر باستخدام أدوات التشريح والمقص الجراحي والملقط. احصد الطحال وضع الطحال المنفصل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع ~ 5 مل من وسائط معهد روزويل بارك التذكاري الكاملة (cRPMI) على الجليد. < / > ملاحظه: يتكون RPMI الكامل من 10٪ مصل بقري جنين (FBS) ، و 2 ملي مولار L-glutamine ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
   1. لحصاد طحال الفأر ، قم بعمل شق 5 سم في الفراء والجلد على طول الجانب الأيسر من الفأر في منتصف الطريق بين الساقين الأمامية والخلفية بالمقص. افتح تجويف الجسم ~ 5 سم وقم بإزالة الطحال باستخدام الملقط. الطحال هو لون حبة الكلى وهو أطول ومسطح من الكلية المجاورة.
3. صب محتويات الخطوة 1.2 على مرشح معقم 70 ميكرومتر متصل بأنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. افصل الطحال ميكانيكيا إلى معلق أحادي الخلية عن طريق دفع الطحال عبر الفلتر باستخدام مكبس حقنة سعة 5 مل حتى لا يبقى لب الطحال على سطح المرشح.
4. قم بتكسير خلايا الطحال باستخدام جهاز طرد مركزي على سطح العمل الدوار المتأرجح عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. صب بعناية المادة الطافية تبقى خلايا الطحال المحببة في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
6. لإزالة خلايا الدم الحمراء ، أعد تعليق خلايا الطحال المحببة في 1 مل من محلول تحلل الأمونيوم - كلوريد - البوتاسيوم (ACK) لمدة 3 دقائق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اخلط جيدا.
7. قم بإخماد المخزن المؤقت لتحلل ACK ب 15 مل من cRPMI.
8. حبيبات الخلايا الليمفاوية كما هو موضح في الخطوة 1.4.
9. أعد تعليق تعليق الخلية في 5 مل من cRPMI في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ضع العينات على الثلج.
   1. لحساب الخلايا ، انقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.6 مل وقم بتخفيفه بنسبة 1: 1 باستخدام محلول Trypan الأزرق. بعد ذلك ، قم بالنقل إلى مقياس الدم أو نظام عد الخلايا الآلي.
10. بعد العد ، اعتمادا على تركيز الخلية في تعليق الخلية كما في الخطوة 1.9 ، قم بتكسير الخلايا في جهاز طرد مركزي منضدي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق للتحضير لإضافة وسائط cRMPI التي تحتوي على صبغة إستر Indo-1 AM.
11. احسب حجم إعادة تعليق الخلايا لتحقيق 10-12 × 10⁶ خلايا / مل. هذا تركيز 2x من إجمالي عدد الخلايا المطلوب.
12. أعد تعليق الخلايا في حجم cRPMI المحسوب في الخطوة 1.11. ضع الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ إما في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع تهوية الغطاء أو لوحة زراعة الأنسجة.

فئة

2. صبغة نسبية Indo-1 ووضع العلامات على الأجسام المضادة الفلورية

1. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، أضف 50 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى قارورة تحتوي على 50 ميكروغرام من Indo-1 AM. تركيز محلول المخزون هو 1 ميكروغرام / ميكرولتر < br / > ملاحظه: يتم توفير DMSO في قوارير صغيرة مع المجموعة لمنع أي أكسدة ل DMSO.
2. قم بتخفيف كمية المخزون (1 ميكروغرام / ميكرولتر) في الحجم التجريبي المناسب (الذي تم إنشاؤه في 1.11) من cRPMI بتركيز 6 ميكروغرام / مل ، بتركيز 2x. لا تقم بتخزين Indo-1 في محلول مائي.
   ملاحظه: يمكن استخدام المخازن المؤقتة الأخرى التي تحتوي على الكالسيوم المضاف حسب احتياجات الخلية.
3. ضع الوسائط الكاملة مع Indo-1 جانبا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظه: استخدم الحد الأدنى من تركيز Indo-1 AM ester اللازم للحصول على إشارة مناسبة. يجب معايرة هذا لأنواع مختلفة من الخلايا. عادة ما يكون التركيز بين 3-5 ميكرومتر كافيا. بالنسبة للخلايا التائية الأولية ، يزيد تحميل الخلايا ب Indo-1 بتركيز >5 ميكروغرام / مل من متوسط شدة الفلورسنت (MFI) فوق سجل 6 على مقاييس التدفق الخلوي الطيفي. إذا حدث هذا ، قلل من شدة الليزر فوق البنفسجي (UV) وقم بمعايرة Indo-1 إلى تركيز أقل.
4. قم بتخفيف تعليق الخلية المعد مسبقا (في الخطوة 1.12) ، 1: 1 في cRPMI ، بما في ذلك وسائط Indo-1 2x المصنوعة في الخطوة 2.2. تأكد من أن الخلايا بتركيز يتراوح بين 5-6 × 10⁶ / مل
   ملاحظه: لا تقم بصبغ التحميل غير الملوثة بالتحكم في البقع المفردة أو علامات السطح بأدوات التحكم في خلية البقع المفردة باستخدام Indo-1. ستؤدي إضافة Indo-1 إلى عناصر التحكم في الأجسام المضادة للبقع المفردة إلى إنشاء عينة متعددة الألوان بسبب إضافة Indo-1 إلى الخلايا الملونة المفردة. قم بتضمين حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين جلايكول (EGTA) المضاف إلى لوحة العينة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.6.
5. أضف 1 مل من الخلايا / البئر / الحالة التجريبية في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا.
6. قم بإنشاء عنصر تحكم ملطخ واحد لعينة Indo-1 (الخالية من الكالسيوم) باستخدام خلايا محملة بالصبغة Indo-1 سابقا وأضف EGTA إلى التركيز النهائي البالغ 2 ملليمتر. سيقوم EGTA بتخلب الكالسيوم في معلق الخلية ، مما يعطي عينة تحكم أنظف.
   1. قم بإنشاء تحكم إيجابي Indo-1 (Indo-1 مرتبط بالكالسيوم) عن طريق إضافة 50 ميكرومتر من الأيونومايسين إلى تعليق الخلية المحملة بالصبغة في مقياس التدفق الخلوي. الأيونومايسين هو أيونوفور الكالسيوم القابل للاختراق في الغشاء الذي يربط أيونات الكالسيوم ويسهل نقل أيونات الكالسيوم إلى الخلايا.
7. قم بإنشاء بئر للتحكم السلبي البيولوجي بدون فلوروفورات أو صبغة Indo-1.
8. قم بإنشاء بئر للتحكم في البقع الفردية لأي مجموعات خلايا إضافية ذات أهمية (الأجسام المضادة المحددة من قبل المستخدم) باستخدام الفلوروفورات المترافقة بالأجسام المضادة في تصميم لوحة قياس التدفق الخلوي. لن تشمل هذه الصبغة النسبية Indo-1.
9. أضف الجسم المضاد الذي يمنع مستقبلات Fc (~ 2 ميكروغرام / 1 × 10⁶ خلايا) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، قبل إضافة أجسام مضادة إضافية مترافقة بالفلوروكروم لتلوين السطح.
10. احتضان اللوحة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
11. أعد تعليق الخلايا في طبق مكون من 12 بئرا عن طريق النقر برفق على اللوحة كل 15 دقيقة.
12. امزج وقم بإزالة الحجم الكامل للخلايا المعلقة في الوسائط من اللوحة المكونة من 12 بئرا. ثم أضف تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل.
13. قم بتكسير الخلايا في جهاز طرد مركزي دقيق عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب المادة الطافية وغسل الخلايا بإضافة 1 مل من cRPMI الدافئ مسبقا. بيليه مرة أخرى وصب المادة الطافية.
    ملاحظه: يؤدي غسل الخلايا إلى إزالة أي جسم مضاد متبقي يحجب Fc.
14. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من cRPMI في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل واحتضان كل أنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية عند 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، مع ترك الجزء العلوي من الأنبوب مفتوحا قليلا للسماح بتبادل الغازات. هذا يسمح بإزالة الأسترة الكاملة لاسترات AM داخل الخلايا.
15. انقل الخلايا مرة أخرى إلى صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا ، إذا لزم الأمر. يمكن إضافة أجسام مضادة مضافة بالفلوروكروم المعايرة المحددة من قبل المستخدم في مرحلة الراحة.
    ملاحظه: تشمل العلامات المستخدمة في لوحة الطرق: Ghost 540 و CD4 و CD8 و TCRβ و TCRγδ و CD25 و CD1d / α-galcer tetramer. يتم اختيار العلامات لتحليل المجموعات الفرعية للخلايا التائية.
    1. قم بإنشاء مزيج رئيسي من جميع الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم المحددة من قبل المستخدم وفقا لأنواع الخلايا ذات الأهمية بحجم معاير مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل.
    2. أضف مزيجا رئيسيا محسوبا ل 1 مل من حجم الخلية ، اعتمادا على الأجسام المضادة الممعايرة للخلايا الراحة. < / > ملاحظه: تتمثل ميزة التلوين في الخطوة 2.15 بدلا من الخطوة 2.18 اللاحقة في أن التلوين في الخطوة 2.15 سيقلل من وقت الحضانة الإجمالي للتجربة. ومع ذلك ، فإن التلوين بحجم إجمالي قدره 1 مل في الخطوة 2.15 يزيد من استخدام الأجسام المضادة.
16. بعد الراحة ، قم بتكسير الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظه: يمكن تكوير الخلايا الموجودة في لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا في اللوحة باستخدام ملحق جهاز طرد مركزي. خلاف ذلك ، قم بتكسير الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل.
17. اغسل الخلايا عن طريق تعليق الحبيبات في 1 مل من 4 درجات مئوية cRPMI بارد وحبيبات الخلايا مرة أخرى كما في الخطوة 2.16. ضع الخلايا على الجليد.
    ملاحظه: إذا كان سطح الخلايا تلطيخ بشكل منفصل ، بعد إزالة الأسترة في الخطوة 2.18 ، هناك حاجة إلى حجم أقل للجسم المضاد. يمكن إجراء تلطيخ السطح في هذه الخطوة بعد مرحلة الراحة في مخزن مؤقت للتدفق البارد (1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) مع إضافة 1٪ FBS) ، باستخدام الأجسام المضادة المحددة من قبل المستخدم ، على الجليد لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا بعد البقعة في cRPMI كما في الخطوة 2.17.
    1. أضف بقعة البقاء Ghost540 المخففة 1: 7,500 في DPBS إلى العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تقتل الحرارة الخلايا عند 55 درجة مئوية على كتلة الاحترار للتحكم في الحية / الميتة الملونة الفردية. < / > ملاحظه: يتم إجراء تلطيخ الصبغة الوظيفية للبقاء للقضاء على الخلايا الميتة في تحليل قياس التدفق الخلوي بدون FBS. يمكن أن تتفاعل FBS مع أصباغ الأمين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
18. أعد تعليق العينات الفردية في 500 ميكرولتر من cRPMI (خال من الفينول باللون الأحمر) باستخدام أنبوب تدفق البوليسترين سعة 5 مل مع غطاء. < br / > ملاحظه: يمكن ترك الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ساعة.
19. قم بتسخين كل أنبوب سعة 5 مل يحتوي على خلايا ، بشكل فردي ، إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام حبة لمدة 7 دقائق قبل التحليل على مقياس التدفق الخلوي ، مع الحفاظ على الوقت متسقا بين العينات. استخدم مؤقتا.

فئة

3. أنبوب حمام الخرزة: الحفاظ على درجة الحرارة أثناء تحليل تدفق الكالسيوم

1. أضف حبات الاستحمام إلى حمام مائي صغير بدون إضافة ماء ؛ قم بتسخين حتى 37 درجة مئوية.
2. قم بقص أنبوب مخروطي بسعة 50 مل بعناية إلى نصفين ، عند علامة 25 مل ، بشفرة حلاقة ؛ تخلص من الجزء العلوي من الأنبوب.
3. املأ الأنبوب المقطع إلى نصفين 3/4 من الطريق بخرز الحمام.
4. ضع الأنبوب الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.2 في حمام الخرز الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.1. اجلب الأنبوب والخرز إلى 37 درجة مئوية.
5. قم بتوصيل حمام الخرزة بمأخذ كهربائي بجوار مقياس التدفق الخلوي من أجل الحفاظ على درجة الحرارة استعدادا لتحليل العينة.
6. أضف قطاعا مخروطي الستايروفوم سعة 50 مل لتثبيت أنبوب واحد لوضع الأنبوب في مكانه أثناء التشغيل على مقياس التدفق الخلوي. سيؤدي ذلك إلى التخلص من الحاجة إلى إمساك الأنبوب يدويا طوال مدة تحليل المنحنى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 12 لوحة معالجة بئر TC علاج الخلية 229111 50 مل مخروطي الشكل غرينر بيو 1 41-12-17-03 50 مل أنابيب الطرد المركزي البولي بروبلين مع غطاء 5 مل أنابيب تدفق البوليسترين كورنينج 352052 حقنة 5 مل حقنة BD 309646 يتم استخدام المكبس فقط يتم التخلص من Sheith مرشح 70uM غرينر بيو 1 542070 aCD3 (17A2) بيوليجند 100202 عازلة تحلل AKC جيبكو A1049201 مقياس التدفق الطيفي الشفقي https://cytekbio.com/pages/aurora حبات الحمام كوليبارمر العنصر # UX-06274-52 CD19 PE تونبو 50-0193-U100 CD1d Tetramer APC المؤسسه CD25 PECy7 العلوم الحيوية 15-0251 CD4 APC Cy7 تونبو 25-0042-U100 CD8a FITC العلوم الحيوية 11-0081-85 حاضنة الخلية علمي رسمي ملقط أدوات التشريح ماكيسون #487593 ملقط الأنسجة McKesson Adson 4-3 / 4 بوصة طول مكتب الصف الفولاذ المقاوم للصدأ غير معقم مقبض الإبهام 1 × 2 الأسنان مقص أدوات التشريح ماكيسون #970135 مقص التشغيل McKesson Argent™ 4-1 / 2 بوصة الجراحية الصف الفولاذ المقاوم للصدأ الإصبع الخاتم مقبض مستقيم حاد تلميح / طرف حاد DPBS 1x جيبكو 14190-136 DPBS EGTA صياد NC1280093 FBS هيكلوند SH30071.03 الكثير AE29165301 برنامج FlowJo https://www.flowjo.com/ صبغ إستر Indo1-AM العلوم الحيوية 65-085-39 صبغة تحميل الكالسيوم الأيونومايسين ميليبور 407951-1 ملغ الشبح الحي / الميت 540 تونبو 13-0879-T100 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل مختبرات الضوء أ -7001 البنسلين / الستربتومايسين / L-الجلوتامين جيبكو هاتف: 10378-016 PRN694 ميد كيم إكسبريس هاي-12688 CD16/CD32 منقى مضاد للفأر (درع FC) (2.4G2) تونبو 70-0161-M001 كتلة FC RPMI جيبكو 1875093 + فينول أحمر خال من الفينول RPMI جيبكو 11835030 - فينول أحمر جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة بيكمان كولتر اليجرا612 TCRβ PerCP Cy5.5 العلوم الحيوية 45-5961-82 TCRγ / δ PE Cy5 العلوم الحيوية 15-5961-82 حزمة كاشف Vi-Cell Blu رقم المنتج: C06019 يشمل تريبان Vi-Cell بلو بيكمان كولتر حمام مائي حمام فيشر براند جاف