اختبار لتحديد ارتباط نوروفيروس VLPs البشري بالبكتيريا المعوية

الملخص

المصدر: Madrigal، J. L.، et al. قياس الجسيمات الشبيهة بفيروس نوروفيروس البشري المرتبطة بالبكتيريا المتكافئة باستخدام قياس التدفق الخلوي. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو فحصا لقياس الجسيمات الشبيهة بفيروس نوروفيروس البشري (VLPs) المرتبطة بالبكتيريا المعوية البشرية. يتم خلط المعلقات البكتيرية مع VLPs وتحضنها للسماح بتكوين مجمعات بكتيريا VLP. ثم يتم تصنيف المجمعات بأجسام مضادة خاصة ب VLP الموسومة بالفلوروفور ، متبوعة بالتصور والقياس الكمي القائم على قياس التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للبكتيريا المرتبطة ب VLP.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. فحص مرفق VLP - البكتيريا

تنبيه: تعد VLPs البشرية لمستوى السلامة البيولوجية (BSL) -2 ، ويجب تنفيذ جميع الأعمال التي تنطوي على VLPs في خزانة السلامة البيولوجية. يجب إجراء تحضير الثقافات البكتيرية قبل فحص التعلق باستخدام ظروف السلامة المناسبة للكائن الحي.

1. تحضير الكاشف
   1. 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)
      1. قم بإعداد 1 لتر من 10x PBS عن طريق إذابة عبوة في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات (DI).
      2. محلول الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة.
      3. قم بإعداد محلول 1x عن طريق تخفيف المحلول أعلاه 1:10 في ماء DI.
      4. يقوم الفلتر بتعقيم المحلول عن طريق تمريره عبر مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
   2. 5٪ BSA
      1. أضف 5 جم من مسحوق ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى 100 مل من PBS لتوليد محلول 5٪ (وزن / حجم).
      2. امزج المحلول عن طريق الدوامة أو باستخدام قضيب تقليب معدني على طبق التحريك حتى تذوب التكتلات.
      3. تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
      4. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   3. المخزن المؤقت لصبغة قياس التدفق الخلوي (FCSB)
      1. تم تصفية FCSB المشتراة (انظر جدول المواد) من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
      2. قم بتخزين المحلول المتبقي عند 4 درجات مئوية.
   4. 5٪ المخزن المؤقت للحجب (BB)
      ملاحظه: استعد طازجا في كل مرة.
      1. أضف 0.5 جم من BSA إلى 10 مل من FCSB المعقم.
      2. دوامة لخلط العينة جيدا واتركها على الثلج حتى الاستخدام.
2. اقتران الأجسام المضادة
   1. اقتران الأجسام المضادة لفيروس نوروفيروس GII البشري (انظر جدول المواد) مع r-phycoerythrin (PE) باستخدام مجموعة وضع العلامات على الأجسام المضادة R-PE وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
   2. قم بتخزين الجسم المضاد المترافق في الظلام عند 4 درجات مئوية لاستخدامه في المستقبل في تحليل مقايسة مرفق البكتيريا VLP.
      ملاحظه: يجب معايرة الجسم المضاد الأساسي قبل استخدامه في مقايسة مرفق بكتيريا VLP لتحديد التركيز المناسب اللازم لتحليل قياس التدفق الخلوي. يجب إجراء معايرة الأجسام المضادة في كل مرة يتم فيها إجراء تفاعل الاقتران ولكل بكتيريا مستخدمة في مقايسة المرفقات.
3. معايرة الأجسام المضادة
   1. تمييع الجسم المضاد لفيروس نوروفيروس البشري المترافق 100 ضعفا ، مع تخفيف أولي قدره 1: 100 وتخفيف نهائي قدره 1: 600 (ستة تخفيفات في المجموع).
   2. قم بإجراء مقايسة مرفق الفيروس كما هو موضح أدناه مع الاستثناء التالي: في الخطوة 1.5.7 ، أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 350 ميكرولتر من 5٪ BB.
   3. قسم العينة إلى سبعة حصص سعة 50 ميكرولتر.
   4. أضف 50 ميكرولتر من كل تخفيف للأجسام المضادة إلى أنبوب واحد.
   5. أضف 50 ميكرولتر من 5٪ BB إلى الأنبوب السابع كعنصر تحكم غير ملطخ.
   6. قم بإجراء قياس التدفق الخلوي على جميع العينات كما هو موضح أدناه.
   7. قارن عينات الأجسام المضادة المخففة بعناصر التحكم غير الملوثة وبعضها البعض. يجب اختيار أدنى تركيز للجسم المضاد لا يؤدي إلى انخفاض أو فقدان الإشارة الإيجابية للمقايسات اللاحقة.
4. تحضير البكتيريا
   1. تنمو البكتيريا في 40 مل من الوسط السائل المناسب في ظل الظروف الجوية المناسبة حتى تصبح البكتيريا في المرحلة الثابتة.
      1. تنمو مزارع Enterobacter عباءة هوائية طوال الليل في مرق لوريا عند 37 درجة مئوية ، وتهتز عند 200 دورة في الدقيقة للوصول إلى المرحلة الثابتة.
      2. تنمو مزارع Lactobacillus gasseri في مرق De Man و Rogosa و Sharpe (MRS) في أنابيب غطاء لولبي أسود دون اهتزاز في حمام مائي تم ضبطه على 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة للوصول إلى المرحلة الثابتة.
   2. انقل مزارع الطور الثابتة لتنظيف 50 مل من الأنابيب المخروطية وعينات أجهزة الطرد المركزي عند 2,288 × جم لمدة 10 دقائق لحبيبات البكتيريا.
   3. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 13 مل من 1x PBS المعقمة. كرر خطوة الغسيل هذه لغسلتين.
   4. قم بالطرد المركزي للعينات مرة أخرى ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق العينات في 20 مل من 1x PBS.
      ملاحظه: إذا كانت حبيبات الخلية صغيرة ، فيمكن تقليل حجم إعادة التعليق.
   5. قم بقياس OD₆₀₀ للثقافة.
   6. باستخدام منحنى قياسي ، حدد وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) لكل مل من المزرعة المغسولة.
   7. تمييع البكتيريا باستخدام 1x PBS لضبط تركيز الثقافة إلى 1 × 10⁸ CFU / مل.
   8. انقل 1 مل من المزرعة البكتيرية 1 × 10⁸ CFU / مل إلى أنابيب الطرد المركزي المطلوبة 1.5 مل.
   9. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق.
   10. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 1 مل من BSA المعقم 5٪.
   11. احتضان الأنابيب لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع دوران مستمر.
5. مرفق الفيروسات
   1. من خلال العمل داخل خزانة السلامة الحيوية BSL-2 ، أضف 10 ميكروغرام من نوروفيروس البشري (HuNoV) VLPs (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب يحتوي على بكتيريا معلقة في PBS وتخلط جيدا عن طريق سحب العينات.
      ملاحظه: يختلف تركيز VLP مع كل مستحضر VLP. لذلك ، سيختلف الحجم المضاف إلى البكتيريا بين دفعات التحضير ويجب تعديله وفقا لذلك بحيث يتم إضافة 10 ميكروغرام إلى كل أنبوب في التجربة. بالنسبة لعناصر التحكم البكتيرية فقط (على سبيل المثال ، العينات التي لا تحتوي على VLP) ، أضف حجما من PBS يساوي حجم VLP المضاف إلى العينات التجريبية.
   2. احتضان الأنابيب لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع دوران مستمر.
      ملاحظة: يتم استخدام مسدس أنبوبي (انظر جدول المواد) مضبوطة على 40 دورة في الدقيقة أثناء الحضانة.
   3. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق.
   4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 1 مل من PBS.
   5. كرر خطوتي الغسيل 1.5.3 و 1.5.4.
   6. جهاز الطرد المركزي للعينات عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق.
   7. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 150 ميكرولتر من 5٪ BB.
6. تلطيخ الأجسام المضادة
   1. تحضير 5٪ BB.
      طازج ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الأعمال التي تستخدم الجسم المضاد الموسوم بالفلورسنت في الظلام ، ويجب إبقاء الجسم المضاد و BB و FCSB على الجليد.
   2. تمييع الجسم المضاد لفيروس نوروفيروس البشري GII 1: 125 لعينات E. cloacae و 1: 150 ل L. gasseri عينات في 5٪ BB ، وتحضير 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة لكل عينة.
   3. قم بتخفيف الجسم المضاد للنمط المتماثل بنفس الطريقة التي تم بها تخفيف الجسم المضاد لفيروس نوروفيروس البشري GII لكل بكتيريا في 5٪ BB ، مما يؤدي إلى تحضير 50 ميكرولتر من التحكم في النمط النظيري المخفف لكل عينة.
   4. قسم كل عينة فحص مرفق من الخطوة 1.3.7 إلى ثلاثة حصص 50 ميكرولتر عن طريق نقلها إلى أنابيب طرد مركزي نظيفة سعة 1.5 مل.
   5. أضف إلى المجموعة الأولى من العينات، 50 ميكرولتر من BB. ستكون هذه المجموعة هي عناصر التحكم غير الملوثة (Uns).
   6. أضف 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة ل GII إلى المجموعة الثانية. ينتج عن هذا تركيز نهائي للجسم المضاد يبلغ 1: 250 ل E. cloacae و 1: 300 ل L. gasseri. ستكون مجموعة العينات هذه هي العينات الملطخة (AB).
   7. أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد للنمط الإسوي المخفف إلى المجموعة الثالثة. ستكون هذه المجموعة هي عناصر تحكم النمط المتماثل (IC). تخلط جيدا عن طريق سحب العينات. احتضان العينات على الجليد وفي الظلام لمدة 30 دقيقة.
   8. جهاز طرد مركزي جميع العينات عند 10،000 × جم لمدة 5 دقائق.
   9. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق العينات في 100 ميكرولتر من FCSB.
   10. جهاز الطرد المركزي جميع العينات عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق.
   11. جهاز طرد مركزي جميع العينات عند 10،000 × جم لمدة 5 دقائق.
   12. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق العينات في 150 ميكرولتر من FCSB.
   13. انقل كل عينة إلى أنبوب FCSB يحتوي على 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FCSB بحجم إجمالي يبلغ 550 ميكرولتر.
   14. احتفظ بالعينات عند 4 درجات مئوية حتى يتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي.
       ملاحظه: يتم إجراء قياس التدفق الخلوي في غضون 4 ساعات من تلطيخ الأجسام المضادة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 5 مل البوليسترين أنابيب مستديرة القاع مع غطاء مصفاة الخلية كورنينج 352235 بعد تلطيخ الأجسام المضادة ، يتم نقل العينة إلى أنابيب لتحليل قياس التدفق الخلوي. AnaeroPack الترمو: العلمية R681001 عبوة الغاز اللاهوائية المستخدمة في استزراع Lactobacillus gasseri برنامج BD FacsDiva مقياس التدفق الخلوي BD LSR Fortessa ألبومين مصل الأبقار كواشف فيشر الحيوية ص1605 تستخدم لقياس التدفق الخلوي مخزن البقع لقياس التدفق الخلوي (FCSB) BD Biosciences 554657 تستخدم لقياس التدفق الخلوي التحكم في النمط المتشاوي للماوس IgG2b (eBMG2b) ، PE ، eBioscience ثيرمو فيشر العلمي 12473281 التحكم في النمط المتماثل. يتم شراء هذا الجسم المضاد في شكل مترافق من الشركة المصنعة. مسحوق MRS BD Biosciences هاتف: 288130 تستخدم لإعداد وسائل الإعلام وزراعة Lactobacillus gasseri. قفيصة نوروفيروس G2 الجسم المضاد أحادي النسيلة (L34D) ثيرمو فيشر العلمي MA5-18241 الأجسام المضادة نوروفيروس GII. هذا الجسم المضاد متاح فقط في الشكل غير المترافق ، وبالتالي يجب أن يكون مترافقا بالفلورسنت قبل استخدامه في فحوصات قياس التدفق الخلوي المحددة. في هذا البروتوكول ، كان PE هو الفلور المختار ، ومع ذلك ، يمكن اختيار جزيئات الفلورسنت الأخرى التي تناسب مقياس التدفق الخلوي الذي يستخدمه الباحث. نوروفيروس GII.4 VLP البنية الحيوية الإبداعية سي بي إس-V700 فيروس نوروفيروس البشري مثل الجسيمات ، تم إنشاء VLPs باستخدام نظام الفيروس العصاري وأعيد تعليقه في محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 10٪ جلسرين. أجرى المؤلفون تحليلا مستقلا لتتبع البصر النانوي لتحديد تركيز جسيمات VLPs. التركيز حوالي 1011 VLPs لكل مليلتر. بناء على تركيز البروتين في VLPs ، تتم إضافة ما يقرب من 200 جسيم لكل بكتيريا في فحوصات مرفق VLP. برنامج تلفزيوني 10X كواشف فيشر الحيوية بي ت 665 خفف إلى 1X قبل الاستخدام. SiteClick R-PE طقم وضع العلامات على الأجسام المضادة ثيرمو فيشر العلمي S10467 مجموعة الاقتران المستخدمة في اختبار الأجسام المضادة غير المترافقة. كلوريد الصوديوم فيشر ساينتيك S271 تستخدم لإعداد الوسائط التربتون أوكسويد لب0042 تستخدم لإعداد الوسائط مسدس الأنبوب ثيرموفيشر العلمي 88881001 تستخدم في فحص مرفق الفيروسات: البكتيريا. اضبط على السرعة القصوى (40 دورة في الدقيقة). مستخلص الخميرة BD Biosciences هاتف: 212750 تستخدم لإعداد الوسائط اجار سيغما أ 7002 تستخدم لإعداد الوسائط