فحص في الجسم الحي للكشف عن الانقسام في الديدان الخيطية المعدلة وراثيا

الملخص

المصدر: Fang ، E. F. ، et al. في المختبر وفي الجسم الحي الكشف عن انقسام الفرح في الخلايا البشرية ، C. elegans ، و Mice. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو فحصا في الجسم الحي لدراسة الانقسام في Caenorhabditis elegans. عند تعريض الديدان الخيطية لدواء محفز للانقسام ، يتم تقييم حدوث الانقسام عن طريق التوطين المشترك بين DCT-1 ، وهو مستقبل انقسام على الميتوكوندريا التالفة ، وبروتين الغشاء الذاتي LGG-1.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الكشف عن Mitophagy في C. ايليجانس

ملاحظة: الديدان الخيطية C. ايليجانس يوفر منصة لفحص الانقسام على المستوى العضوي. يمكن استخدام سلالتين لمراقبة الانقسام: (1) Rosella المستهدفة بالميتوكوندريا (mtRosella) أو (2) مستقبلات الانقسام DCT-1 المدمجة مع GFP جنبا إلى جنب مع علامة البلعمة الذاتية LGG-1 المدمجة مع Discosoma sp. بروتين الفلورسنت الأحمر (DsRed).

1. مراقبة انقسام البكتيريا باستخدام المستشعر الحيوي Rosella
   ملاحظة: Rosella هو مستشعر حيوي جزيئي يجمع بين DsRed غير الحساس للأس الهيدروجيني المدمجة مع متغير GFP حساس للأس الهيدروجيني. يستفيد المستشعر الحيوي Rosella من اختلافات الأس الهيدروجيني بين الليزوزوم الحمضي (درجة الحموضة ~ 4.5) والأجزاء الخلوية الأخرى. تم استخدام هذا المستشعر الحيوي لمراقبة الانقسام القطني بنجاح في خميرة الخميرة والعديد من خطوط خلايا الثدييات ، مثل HeLa و HEK293 و HCT116. قمنا بتكييف هذا المراسل الفلوري المزدوج متعدد الاستخدامات وقمنا بإنشاء الديدان الخيطية المعدلة وراثيا C. ايليجانس التي تعبر عن روزيلا التي تستهدف الميتوكوندريا (mtRosella) في خلايا عضلات جدار الجسم. يشار إلى تحريض الانقسام من خلال انخفاض نسبة GFP / DsRed من mtRosella المضالة.
   1. اليوم 1: اختر يرقات L4 من الديدان التي تعبر عن Rosella التي تستهدف الميتوكوندريا (mtRosella) في خلايا عضلات جدار الجسم على صفيحة وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) المصنفة بالإشريكية القولونية (OP50) باستخدام مجهر التشريح. ضع 10-20 دودة / صفيحة على ثلاث أطباق 3.5 سم على الأقل. احتضان الديدان الخيطية عند درجة حرارة قياسية تبلغ 20 درجة مئوية
      ملاحظه: انظر مرجع تشريح الدودة ، بما في ذلك تحديد يرقات L4 ، وطريقة الانتقاء الذي يستخدم لنقل الديدان من مكان إلى آخر.
   2. اليوم 5: مزامنة الديدان الخيطية عن طريق اختيار 15-20 يرقات معدلة وراثيا L4 ونقلها إلى صفيحة NGM الطازجة OP50. استخدم ما لا يقل عن خمس أطباق لكل حالة تجريبية.
   3. اليوم 7: تحضير لوحات السيارة للأدوية المؤثرة على الانقسام أو الضوابط الإيجابية.
      1. اقتل بكتيريا الإشريكية القولونية (OP50) التي تم زرعها عن طريق تعريض ألواح NGM لمدة 15 دقيقة مع 222 ميكروواط / سم² (شدة) من ضوء الأشعة فوق البنفسجية لضمان عدم استقلاب المركبات المسببة للانقسام بواسطة البكتيريا. يجب أن تتعرض الألواح ب 2,000 جول / م².< / > ملاحظة: الثواني المطلوبة من التعريض الضوئي = 2,000/((الشدة بوحدة ميكروواط/سم2)*100).
      2. أضف مركب (مركبات) ذات أهمية إلى الجزء العلوي من ألواح NGM المصنفة. أضف كمية مكافئة من المركبة المركبة (المذيب المستخدم لإذابة المركب ، مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)) إلى لوحات السيارة كعنصر تحكم سلبي. للتحكم الإيجابي في تحريض الانقسام ، تم استخدام مادة سامة للميتوكوندريا ، باراكوات (تركيز نهائي 8 ملي). أضف محلولا يحتوي على 10 ميكرولتر من مخزون الباراكوات 8 M مع 190 ميكرولتر من ddH₂O أعلى صفيحة أجار لمجموعة المعالجة. بالنسبة لمجموعة المركبات ، أضف محلولا يحتوي على 10 ميكرولتر من DMSO مع 190 ميكرولتر من ddH₂O في الجزء العلوي من لوحة الأجار.
         ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بمحلول عمل الباراكوات لمدة شهر واحد عند 4 درجات مئوية.
      3. قم بتدوير الألواح برفق حتى يغطي الدواء أو السيارة السطح بالكامل. اترك الألواح تجف مع إغلاق الأغطية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة على الأقل قبل نقل الديدان.
         ملاحظه: يمكن أيضا تحضير ألواح الدواء عن طريق إضافة الأدوية في السائل NGM قبل أن يتصلب.
   4. اليوم 7: نقل 10-20 من المعدلة وراثيا البالغة البالغة من العمر يومين المحضرة في الخطوة 2.1.2 إلى لوحات تحتوي إما على الباراكوات أو المركبات ذات الأهمية أو المركبة (DMSO). احتضان المعدلة وراثيا عند 20 درجة مئوية لمدة يومين.
   5. اليوم 9: تحضير 2٪ ضمادات الاغاروز. ثم أضف قطرة واحدة (10 ميكرولتر) من 20 ملي ليفاميسول في M9 لكل وسادة. شل حركة المعدلة وراثيا للتصوير ، عن طريق وضعها في قطرة M9-levamisol. ضع غطاء برفق في الأعلى.
   6. التقط معدلة وراثيا مفردة باستخدام كاميرا متصلة بمجهر اللفائفلور. الحصول على صور فلورية للديدان الخيطية المعدلة وراثيا كاملة التي تعبر عن mtRosella في خلايا عضلة جدار الجسم بتكبير 10X. احفظ الصور التي تم جمعها.
   7. معالجة الصور المكتسبة باستخدام برنامج ImageJ. تحليل خلايا عضلة جدار الجسم الموجودة في رأس الدودة لتجنب التألق الذاتي في أنسجة الأمعاء. قم بقياس متوسط قيمة شدة البكسل والمساحة الإجمالية لكل صورة فلورية لمنطقة رأس كل فقط. لتحليل مجال الاهتمام المحدد:
      1. حدد "تقسيم القناة" ضمن القائمة المنسدلة "الصورة" و "اللون" لتحويل الصور.
      2. استخدم أداة "الاختيار اليدوي" لالتقاط منطقة الفلورسنت ذات الاهتمام.
      3. حدد الأمر "القياس" ضمن القائمة المنسدلة "تحليل" وقم بإجراء تحليل شدة البكسل.
      4. يجب تطبيع شدة البكسل بقسمة الكثافة على المساحة الإجمالية التي تم تحليلها. عند التطبيع ، احسب نسبة GFP إلى DsRed.
   8. استخدم برنامج التحليل الإحصائي إما لإجراء اختبار الطالب (مقارنة بين مجموعتين) أو ANOVA (مقارنة بين مجموعات متعددة) للتحليل الإحصائي مع ملاحظة p < 0.05.
2. تقييم الانقسام باستخدام التعريب المشترك بين DCT-1 و LGG-1
   ملاحظة: DCT-1 هو بروتين غشاء الميتوكوندريا الخارجي يعمل كمستقبل انقسام استجابة لظروف الإجهاد ، على غرار تقويم العظام المفترض BNIP3 و NIX / BNIP3L في الثدييات. وبالتالي ، يتم تقييم بدء الانقسام عن طريق التوطين المشترك بين مستقبلات الانقسام DCT-1 وبروتين الغشاء الذاتي LGG-1 (متماثل الثدييات LC3).
   1. اليوم 1: اختر يرقات L4 للحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن كل من DCT-1 :: GFP و DsRed :: LGG-1 في خلايا عضلات جدار الجسم 5 على صفيحة NGM المصنفة OP50. ضع 5-10 ديدان / صفيحة 3.5 سم ، واستخدم ثلاثة أطباق على الأقل. احتضان الديدان الخيطية عند 20 درجة مئوية
      ملاحظه: توجد الجينات المعدلة وراثيا على بلازميدات منفصلة ولا يتم دمجها في الجينوم. التقط الديدان الخيطية التي تحمل علامات التحويل roll-6 (su1006) و pmyo-2 GFP. فقط الديدان المعدلة وراثيا التي تحتوي على علامتي التحول تعبر عن كل من DCT-1 :: GFP و DsRed :: LGG-1 في خلايا عضلات جدار الجسم.
   2. اتبع الخطوات من 1.1.2-1.1.5.
   3. صور خلايا عضلية أحادية جدار الجسم باستخدام كاميرا متصلة بمجهر متحد البؤر. اكتشف حدود خلايا عضلة جدار الجسم بالكامل والتقط صورا z-stack تحت تكبير 63x. يمكن أيضا استخدام تكبير أعلى.
   4. فتح ومعالجة الصور التي تم الحصول عليها باستخدام البرنامج متحد البؤر. يشار إلى بدء الانقسام من خلال التوطين المشترك لمستقبلات الانقسام (DCT-1:: GFP) إلى علامة البلعمة الذاتية (DsRed:: LGG-1). قم بقياس أحداث التوطين المشترك يدويا في كل كومة من خلايا عضلة جدار الجسم. من الضروري الحفاظ على اتساق جميع إعدادات المجهر والكاميرا (العدسة والمكبر، والمرشحات، ووقت التعرض، والدقة، وشدة الليزر، والكسب، وما إلى ذلك) طوال التجارب. يجب ملاحظة جميع الإعدادات.
   5. استخدم برنامج التحليل الإحصائي إما لإجراء اختبار الطالب (مقارنة بين مجموعتين) أو ANOVA (مقارنة بين مجموعات متعددة) للتحليل الإحصائي مع ملاحظة p < 0.05 كمعنوية. للمقارنات ثنائية الاتجاه ، استخدم اختبار t للطالب (p < 0.05 يعتبر مهما). للمقارنات المتعددة ، استخدم تحليل تباين العامل الفردي (ANOVA) ، الذي تم تصحيحه بواسطة اختبار Bonferroni اللاحق. نوصي بتحليل ما لا يقل عن 50-70 أو 30-50 خلية عضلية في جدار الجسم لكل حالة تجريبية. كرر التجربة ثلاث مرات على الأقل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجهر متحد البؤر Eclipse TE-2000e نيكون #TE-2000ه برنامج المشاركة Volocity #Volocity 6.3 برنامج Zeiss ZEN 2012 البديل برنامج محقق الخلية IN جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة #28408974 وسط زراعة الخلية ثيرموفيشر #DMEM - وسط النسر المعدل من دولبيكو البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) ثيرموفيشر #15140122 مصل الأبقار الجنينية سيجما ألدريتش #12003C-1000 مل حاضنة زراعة الخلايا ثيرموفيشر #Thermo فورما 3110 CO2 حاضنة مغلفة بالماء مجهر epifluorescence زييس زايس اكسيو تصوير Z2 كاميرا أوليمبوس أوليمبوس DP71 مجهر متحد البؤر زييس زايس أكسيو أوبزرفر Z1 برنامج متحد البؤر زييس زين 2012 برنامج تحليل الصور الصورة J تحليل التحديد المشترك ، إلخ https://imagej.nih.gov/ij/ برنامج التحليل الإحصائي شركة GraphPad Software Inc. ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية حزمة برنامج GraphPad Prism مادة لاختيار الدودة Surepure Chemetals #4655 يتكون الانتقاء من سلك إيريديوم عيار 30 ٪ 90٪ بلاتين 10٪ الأشعة تحت الحمراء: N2 ؛ السابقين [pmyo-3 TOMM-20::Rosella] الاستفسار عن المواد إلى Tavernarakis Nektarios الحفاظ على المعدلة وراثيا عند 20 درجة مئوية الأشعة تحت الحمراء: N2 ؛ مثال [pdct-1 DCT-1:: GFP ؛ pmyo-3 DsRed :: LGG-1] الاستفسار عن المواد إلى Tavernarakis Nektarios pmyo-3 TOMM-20::Rosella الاستفسار عن المواد إلى Tavernarakis Nektarios pdct-1 DCT-1 :: GFP الاستفسار عن المواد إلى Tavernarakis Nektarios pmyo-3 DsRed:: LGG-1 الاستفسار عن المواد إلى Tavernarakis Nektarios محلول الباراكوات المخزن المؤقت M9 M9-ليفاميزول عازلة شرائح المجهر الزجاجي والأغطية فيشر ساينتيك #B9992000 ملقط جراحي STERIS لصحة 19 قطعة تعقيم حزمة الاقتصاد مقص جراحي STERIS لصحة 19 قطعة تعقيم حزمة الاقتصاد 1x برنامج تلفزيوني ثيرموفيشر #AM9625 يجب تخفيف 10x PBS إلى 1x PBS باستخدام ddH2O شاكر فيشر ساينتيك # 11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP منضدية مدارية صغيرة في الهواء الطلق منصة شاكر حزمة أ 2٪ وسادة الاغاروز شفرات الاهتزاز أدوات الدقة العالمية #BLADES-2 شفرة أحادية الحافة لوحة معدنية ماجستير #78803988 0.012 بوصة سميكة × 6 بوصة عرض × 12 بوصة طويلة ، 430 صفائح من الفولاذ المقاوم للصدأ تريتون X-100 منظف هيدرات ميثيل فيولوجين ثنائي كلوريد سيجما ألدريتش #856177 الباراكوات حاضنة للديدان الخيطية أكواליטيك حاضنة للحفاظ على 20 درجة مئوية تشريح المجهر المجسم أوليمبوس SMZ645 مجهر متحد البؤر زييس برنامج AxioObserver Z1 للديدان الخيطية (الخطوة 2) مجهر epifluorescence زييس AxioImager Z2 للديدان الخيطية (الخطوة 2) الأشعة فوق البنفسجية المتشابكة فيلبر لورمات الرابط الحيوي - BLX-E365 مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية ؛ 356 نانومتر