مقايسة مناعية للرحلان الكهربائي الشعري للكشف عن المؤشرات الحيوية للبروتين

الملخص

المصدر: Sage، J. M.، et al. استخدام المقايسة المناعية للرحلان الكهربائي الشعري للبحث عن المؤشرات الحيوية المحتملة للتصلب الجانبي الضموري في الصفائح الدموية البشرية. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو بروتوكول المقايسة المناعية للرحلان الكهربائي الشعري للكشف عن المؤشر الحيوي البروتيني المرتبط بالتصلب الجانبي الضموري (ALS) من الصفائح الدموية للدم. يتم تأكيد وجود بروتين المؤشرات الحيوية ALS من خلال الفصل القائم على الحجم لبروتينات الصفائح الدموية متبوعا بالكشف عن التلميء الكيميائي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف

ملاحظة: قم بإعداد جميع العينات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. خلال هذا الإجراء ، ارتد معدات الحماية الشخصية (معاطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية).

1. تحضير مخزن غسيل السترات عن طريق الجمع بين 0.941 جم من السكروز (التركيز النهائي 11 ملم) ، 6.4 مل من كلوريد الصوديوم 5 مولار (كلوريد الصوديوم ، 128 ملي مولار نهائي) ، 5.4 مل من 0.2 مولار فوسفات أحادي الصوديوم (NaH_}2 PO ₄ ، 4.3 ملي مولار نهائي) ، 9.4 مل من 0.2 مولار فوسفات ثنائي الصوديوم (Na_}2 HPO₄ ، 7.5 ملي مولار نهائي) ، 0.352 جم من سترات الصوديوم (4.8 ملي مولار نهائي) ، و 0.115 جم من حامض الستريك (2.4 ملي مولار نهائي). اضبط الحجم الإجمالي إلى 250 مل باستخدام ddH₂O. قم بالتصفية من خلال قرص مرشح 0.45 ميكرومتر واضبط الرقم الهيدروجيني على 6.5. يخزن لمدة تصل إلى 1 سنة عند 4 درجات مئوية. قم بإحضار المحلول إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
2. قم بإعداد المخزن المؤقت للتمزق عن طريق الجمع بين 250 ملي مولار من السكروز ، و 1 ملي مولار من حمض رباعي الأسيتيك من الإيثيلين ديامين (EDTA) ، و 10 ملي مولار تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (Tris-Cl ، الرقم الهيدروجيني 7.4) في حجم نهائي 100 مل. يخزن لمدة تصل إلى عام واحد عند 4 درجات مئوية. أضف 2 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الفوسفاتيز (1: 1000 نهائي) و 1 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الإنزيم البروتيني (1: 2000 نهائي) في 2 مل من محلول التمزق. يحفظ على الثلج حتى الاستخدام. تجاهل المخزن المؤقت للتمزق غير المستخدم.

2. عزل الصفائح الدموية

1. اجمع 8-10 مل من دم الإنسان في أنبوب جمع دم أصفر يحتوي على محلول حمض السترات وسكر العنب (75 ملي مولار سترات ثلاثي الصوديوم ، 124 ملي مولار سكر العنب ، 38 ملي مولار حامض الستريك ، الرقم الهيدروجيني = 7.4 ؛ ACD: الدم = 1: 9). امزج محتوى الأنبوب برفق 5x-6x مع التقليب يدويا.
2. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 200 x g في دوار دلو متأرجح لمدة 20 دقيقة في RT.
3. اجمع البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) (~ 3-4 مل) في أنبوب سفلي مخروطي سعة 15 مل واترك ما يقرب من 0.5 مل من البلازما الغنية بالصفائح الدموية من الطبقة المصقولة (الجزء الضبابي المظهر) لتجنب التلوث. في حالة حدوث أي تلوث بخلايا الدم الحمراء ، كرر هذه الخطوة.
4. الطرد المركزي لعينات PRP عند 1,200 x g لمدة 15 دقيقة في RT.
5. اغسل كريات الصفائح الدموية (P1) عن طريق إعادة التعليق اللطيف في 1 مل من محلول غسيل السترات والحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 1,200 x g لمدة 15 دقيقة في RT.
6. احفظ بيليه الصفائح الدموية النقية. تخلص من المادة الطافية.
7. أعد تعليق كريات الصفائح الدموية في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتمزق الذي يحتوي على كوكتيلات مثبطة.
8. صوتنة تعليق الصفائح الدموية باستخدام مكبر صوت. ضع العينة في دلو ثلج صغير. اضبط الصوتنة على الإعداد 3 لمدة 20 ثانية في الوضع المستمر.
   ملاحظة : نظف المسبار باستخدام مبيض بنسبة 10٪ متبوعا بالماء المقطر.
9. الطرد المركزي العينات الصوتية عند 20,000 x g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الكسور الغشائية. Aliquot المواد الطافية في 60 ميكرولتر وتخزينها في -80 درجة مئوية. تجنب دورات الذوبان / التجميد المتكررة للكسور العصارية الخلوية للصفائح الدموية.

3. التحضير للمقايسة المناعية للرحلان الكهربائي الشعري (CEI)

ملاحظة : تم دمج 100 ميكرولتر من محللة الصفائح الدموية البشرية من مرضى التصلب الجانبي الضموري (ن = 8-10) ، وتم تجميع الأشخاص الأصحاء (ن = 8-10) بشكل منفصل واستخدامها لتحسين الفحص.

1. املأ القوالب التي تم إنشاؤها داخليا لتخطيط CEI (جدول 1) وإعداد العينة (الجدول 2). جدول تحضير خليط العينة ديناميكي وسيقوم تلقائيا بحساب مقدار الحجم الذي يجب إزالته من المصدر.
   ملاحظة: عند إدخال وحدة تخزين المصدر المطلوبة في الجدول الديناميكي 2، سيتم حساب حجم المخزن المؤقت النموذجي 0.1 × تلقائيا.
2. قم بتسمية 25 أنبوب PCR سعة 0.2 مل مسبقا مع الشعيرات الدموية # 1 - # 25 وضعها في رف PCR. وضع على الجليد.
3. أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.6 مل مسبقا: واحد لكل جسم مضاد أولي وتخفيف (إذا لزم الأمر) لاستخدامه، وواحد للمخزن المؤقت للعينة 0.1x، وواحد لللومينول-S/بيروكسيد، وواحد لكل عينة يتم تخفيفها (إذا لزم الأمر). ضعها على الثلج في رف أنبوبي.
4. أخرج المخزن المؤقت للعينة ، ومخزن الغسيل ، ولوحة واحدة ، وخرطوشة متوفرة في وحدة فصل مجموعة CEI الرئيسية 12-230 كيلو دالتون.
5. من الثلاجة 4 درجات مئوية ، أخرج المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة ، والأجسام المضادة الأولية ، والأجسام المضادة الثانوية ، واللومينول ، وبيروكسيد الهيدروجين ، والعبوة القياسية. ضع جميع الكواشف على الجليد باستثناء العبوة القياسية ، والتي تبقى في RT.
   ملاحظة : الكواشف من العبوات القياسية مجففة بالتجميد ومختومة بغطاء من رقائق الألومنيوم. لتقليل فقد المنتج ، يجب تدويرها لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير قبل الفتح. للفتح ، يمكن ثقب أنابيب الكاشف بواسطة طرف ماصة أو سحبها للخلف من الزاوية.
6. لتحضير 400 ملي مولار ثنائي ثيوثريتول (DTT) ، أضف 40 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى الأنبوب الشفاف الذي يحتوي على DTT.
7. لتحضير 40 ميكرولتر من المزيج الرئيسي الفلوري 5x ، أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة 10x و 20 ميكرولتر من محلول DTT المحضر 400 ملي مولار إلى الأنبوب الوردي الموجود في المجموعة.
8. لتحضير السلم البيوتينيل ، أضف 16 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ، و 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة 10x ، و 2 ميكرولتر من محلول DTT المحضر 400 ملي مولار إلى الأنبوب الأبيض الموجود في المجموعة. تخلط برفق وتنقل إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) سعة 0.2 مل لتغيير الطبيعة.
9. قم بإعداد عازلة عينة 0.1x عن طريق إضافة 1.5 ميكرولتر من 10x عينة عازلة و 148.5 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.6 مل. دوامة للخلط ووضعها على الثلج.
10. تحضير تخفيفات الأجسام المضادة المطلوبة. أضف مخفف الأجسام المضادة في الأحجام المخصصة لكل أنبوب طرد مركزي دقيق مسمى مسبقا. إذا كانت الأحجام متطابقة، فاستخدم تقنية سحب العينات العكسية؛ إذا لم يكن الأمر كذلك، فقم بشطف طرف الماصة مسبقا قبل الاستغناء عنها.
    ملاحظة : تم استخدام الجسم المضاد A-TDP-43 والجسم المضاد A-p (S409 / 410-2) TDP-43 في هذا الفحص. تم استخدام الجسم المضاد المضاد ل ERK للرقابة الداخلية لضمان عمل مكونات الفحص.
11. قم بإجراء سحب العينة العكسي لتخفيف الأجسام المضادة كما هو موضح أدناه. بدلا من ذلك ، يمكن العثور على معلومات إضافية في الأدبيات.
    ملاحظة: يفضل سحب العينات العكسي عند توزيع كميات متسلسلة صغيرة من المحاليل. توفر هذه التقنية بعض المزايا: (أنا) توفير حجم دقيق ، (2) القضاء على رغوة الكاشف في فتحة الطرف ، و (3) مثالية للكواشف ذات الحجم الصغير (<5 ميكرولتر) ، والمحاليل اللزجة ، والمحاليل الخافضة للتوتر السطحي ، والمحاليل ذات ضغط البخار العالي.
    1. ضع طرفا مناسبا في ماصة واضغط على المكبس لأسفل حتى المحطة الثانية (الخطوة 2). اغمر طرف الماصة بضعة ملليمترات في المحلول. حرر المكبس ببطء لملء طرف الماصة بالمحلول بينما لا يزال الطرف مغمورا. قم بإزالة الطرف من المحلول واللمس برفق على حافة خزان الكاشف بحيث تتم إزالة السائل الزائد المتبقي على الجزء الخارجي من الحافة.
    2. استغن عن المحلول بالضغط على المكبس حتى المحطة الأولى (الخطوة 1). لا تستغني عن المحلول المتبقي في الحافة.
    3. أفرغ المحلول المتبقي في طرف خزان الكاشف بالضغط على المكبس إلى المحطة الثانية (الخطوة 2). حرر المكبس إلى وضع الاستعداد لخطوة سحب العينات التالية.
    4. أضف الجسم المضاد المطلوب في الأحجام المخصصة لكل أنبوب طرد مركزي دقيق مسمى مسبقا ( الجدول 1 ). لا تشطف طرف الماصة مسبقا: أضفه مباشرة إلى المخفف واغسل الطرف عدة مرات لإزالة الجسم المضاد. ضع الأنابيب على الجليد.
12. لتحضير مزيج عينة CEI ، قم بتنفيذ الخطوات المذكورة أدناه لأنابيب PCR المسماة cap # 2 through cap # 25: هذا بنفس الترتيب كما في الجدول 1 .
    1. افتح جميع الأنابيب، وأضف 1.6 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة الفلورية 5x إلى كل أنبوب باستخدام تقنية سحب العينات العكسية، ثم أغلق كل أنبوب PCR عند إضافة المخزن المؤقت 5x لتقليل فقد العينة.
    2. افتح جميع الأنابيب، وأضف المخزن المؤقت للعينة 0.1x في المجلدات المحددة في الجدول 2 لكل أنبوب، ثم أغلق بعد ذلك مباشرة. إذا كانت الأحجام متطابقة، فاستخدم تقنية سحب العينات العكسي. إذا لم يكن الأمر كذلك، فقم بشطف طرف الماصة مسبقا قبل توزيع المخزن المؤقت للعينة 0.1x.
    3. افتح جميع الأنابيب، وأضف عينة البروتين بأحجام محددة في الجدول 2 إلى كل أنبوب، ثم أغلقه بعد ذلك مباشرة. إذا كانت الأحجام متطابقة، فاستخدم تقنية سحب العينات العكسي. إذا لم يكن الأمر كذلك، فقم بشطف طرف الماصة مسبقا قبل توزيع المخزن المؤقت للعينة 0.1x.
    4. قم بإجراء الطرد المركزي لفترة وجيزة جميع أنابيب PCR في جهاز طرد مركزي على الطاولة (13,000 x g لمدة 30 ثانية) ، ونقر أنابيب PCR / دوامة للخلط ، ثم كرر الطرد المركزي.
    5. انقل جميع أنابيب PCR إلى جهاز تدوير حراري بغطاء ساخن. تشوه العينات عند درجة حرارة ومدة محددة (أي 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق).
       ملاحظة : يجب تحسين درجة حرارة التمسخ ومدته للبروتين المستهدف.
    6. كرر الخطوة 3.12.4.
    7. أعد جميع أنابيب PCR إلى رف الأنبوب وضعها على الجليد.
    8. أثناء خطوة تغيير الطبيعة ، قم بإعداد محلول التطوير (1: 1 luminol-S: محلول بيروكسيد) ، ثم أضف 200 ميكرولتر من luminol-S و 200 ميكرولتر من البيروكسيد. ضعها على الثلج.
    9. لتحميل لوحة CEI مملوءة مسبقا بالعينة المعدة أعلاه ، قم بتوزيع الكواشف والعينات في لوحة الفحص الموضحة في تخطيط الفحص ( الشكل 1 ). تجنب إدخال فقاعات الهواء.
       ملاحظة: إذا كانت الأحجام والمحلول متطابقين، فاستخدم تقنية سحب العينات العكسي. إذا لم يكن الأمر كذلك، فقم بشطف طرف الماصة مسبقا قبل الاستغناء عنه، ولا تطرد الباقي في اللوحة جيدا باستخدام نقطة التبويب الثانية على الماصة. قد تحتوي وحدة الفصل 12-230 كيلو دالتون على دليل تحميل لوحة مرمز بالألوان. ضع هذا الدليل أسفل اللوحة أثناء إضافة الكواشف والعينات إلى البئر ، مما يساعد بصريا عند تحميل العينة. يمكن تنزيل دليل تحميل اللوحة من موقع الشركة أيضا.
       1. أضف 15 ميكرولتر من مزيج البيروكسيد من اللومينول: إلى كل بئر في الصف E.
          ملاحظة : من الناحية المثالية ، قم بإعداد هذا الكاشف قبل الاستخدام مباشرة وإضافته إلى كل بئر. إذا كان هذا غير مريح ، فيمكن تحضير هذا الخليط قبل تحميل اللوحة بأكثر من 30 دقيقة.
       2. في الصف D ، إلى البئر D1 ، أضف 10 ميكرولتر من الستربتافيدين-HRP.
       3. في الصف D ، إلى الآبار D2-D25 ، أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المحدد.
       4. في الصف B ، أضف 10 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة إلى كل بئر.
       5. في الصف C ، إلى البئر C1 ، أضف 10 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة.
       6. في الصف C ، إلى الآبار C2-C25 ، أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المحدد.
       7. في الصف A ، إلى البئر A1 ، أضف 5 ميكرولتر من السلم البيوتينيل من أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل # 1.
       8. في الصف أ ، إلى الآبار A2-A25 ، أضف 3 ميكرولتر من العينة ، أنابيب PCR # 2-# 25 في الآبار المقابلة # 2-# 25.
       9. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى كل مخزن غسيل مخصص.
       10. جهاز الطرد المركزي للوحة لمدة 5 دقائق عند 1,000 x g في RT.

الجدول 1: نموذج تحميل لوحة فحص CEI.

الجدول 2: نموذج تحضير خليط العينة التفاعلية. بعد إدخال تركيز بروتين المخزون من عينات غير معروفة ، ستقوم الخلايا التفاعلية تلقائيا بحساب مقدار الحجم الذي يجب استخدامه لتحضير مزيج العينة.

النتائج

الشكل 1: تخطيط الفحص. يمكن إجراء كل من الأجسام المضادة الأولية وتحسين عينة البروتين المستهدف في اختبار واحد. تمثل الشعيرات الدموية 2-7 و 8-13 و 14-19 و 20-24 تركيزات مختلفة من البروتين ونطاقات الأجسام المضادة الأولية. تمثل الشعيرات الدموية 25 تحكما إيجابيا. تم استخدام الجسم المضاد ل ERK. ومع ذلك ، يمكن تضمين أي تحكم إيجابي مناسب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
12-230 كيلو دالتون مجموعة الفصل	بروتين بسيط	SM-W004	يحتوي على لوحة فحص مملوءة مسبقا وخرطوشة شعرية 25 قناة
3000 جرام Thermocycler	Techne	FTC3G/02	استخدمنا هذه الصناعة الحرارية لتسخين مزيج العينة
مجموعة الكشف عن مكافحة الماوس	بروتين بسيط	042-205	يتضمن الجسم المضاد الثانوي المترافق ب HRP ، والمخزن المؤقت ، وكاشف اللومينول ، وعلامة الوزن الجزيئي
الجسم المضاد ل P (S409-410) TDP-43	بروتينتك	22309-1-AP	الجسم المضاد الأولي الذي يتعرف على TDP-43 الفسفوري
الجسم المضاد المضاد ل P (S409-412) TDP-43	كوزمو بيو الولايات المتحدة الأمريكية	TIP-PTD-P02	الجسم المضاد الأولي الذي يتعرف على TDP-43 الفسفوري
مجموعة الكشف عن الأرانب	بروتين بسيط	DM-001	يتضمن الجسم المضاد الثانوي المترافق ب HRP ، والمخزن المؤقت ، وكاشف اللومينول ، وعلامة الوزن الجزيئي
الجسم المضاد المضاد ل TDP-43 (عموم)	بروتينتك	10782-2-AP	الجسم المضاد الأولي الذي يتعرف على بروتين TDP-43 الكامل
سونيك ديسمبراتور. نموذج 100	فيشر العلمي		سونيكاتور تستخدم لتمزق غشاء الخلية. تم إيقاف هذا النموذج (موديل XL2000-350)
جهاز طرد مركزي سطح الطاولة	إيبندورف	22625004	الموديل # 5810 مع دلو لوحة متأرجحة
ويس محلل	بروتين بسيط	55892-WS-2203	يقوم بإجراء الرحلان الكهربائي للهلام الشعري
بوصلة ل SimpleWestern (SW)	بروتين بسيط	الإصدار 4.0.0.	Compass for SW هو تطبيق التحكم وتحليل البيانات لأدوات SimpleWestern