اختبار مناعي مغناطيسي قائم على الجسيمات النانوية باستخدام جهاز ميكروفلويديك

1. املأ القنوات بالماء المقطر باستخدام حقنة. تأكد من عدم وجود تسرب أو مقاومة للتدفق. اغمر الجهاز في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق لإزالة أي مادة أكريليك أو لاصقة أو غير مرغوب فيها متبقية داخل القنوات.
2. أفرغ الماء داخل قنوات الجهاز. استخدم حقنة لإدخال محلول مانع محضر من 5٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل بقري (BSA) مخفف في محلول ملحي 1x Tris (TBS) وتم ترشيحه مسبقا من خلال مرشح حقنة بولي إيثر سلفون (PES) 0.2 ميكرومتر.
3. تحضير معلق من جزيئات الحديد الدقيقة بقطر 7.5 ميكرومتر في 5٪ BSA.
   ملاحظه: تم تشغيل الجسيمات الدقيقة سابقا بطبقة السيليكا والبولي إيثيلين جلايكول (PEG) التي تمنح مقاومة لامتصاص البروتين.
4. احتضان الرقاقة وتعليق الجسيمات الدقيقة بمحلول الحجب لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. إذا أمكن ، اترك الحظر طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

2. تشكيل مصيدة الجسيمات الدقيقة

1. أدخل الجسيمات الدقيقة في الرقاقة بإبرة حقنة من خلال خرطوم مخرج القناة الجانبية. ضع الشريحة عموديا واترك الجسيمات الدقيقة تتدفق تحت تأثير الجاذبية عبر القناة الجانبية. قم بتدوير الرقاقة 180 درجة في خطوتين بزاوية 90 درجة واسمح للجسيمات الدقيقة بالاستهداف والانضغاط عند تقييد 5 ميكرومتر.
2. قم بإزالة الجسيمات الدقيقة الزائدة عن طريق الجاذبية التي تدور بزاوية 45 درجة باتجاه القناة الجانبية.
3. احتفظ بالجهاز في وضع مستقيم لتجنب التراجع عن مصيدة الجسيمات الدقيقة. انظر الشكل 1 ب للحصول على ملخص لعملية تكوين مصيدة الجسيمات الدقيقة.

1. تحضير الجسيمات النانوية
   1. خذ 2 ميكرولتر من تعليق الجسيمات النانوية 100 نانومتر المقترنة مسبقا بالليزوزيم (نموذج المستضد). أضفه إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من محلول الحظر. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   2. أضف 150 ميكرولتر من محلول الغسيل (1x TBS ، 0.05٪ Tween 20).
   3. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل في فاصل مغناطيسي. احتفظ بها لمدة 15 دقيقة للسماح بفصل الجسيمات النانوية (الشكل 2).
      ملاحظه: الحد الأدنى لحجم الفاصل المغناطيسي هو 200 ميكرولتر. تجنب استخدام حجم أصغر.
   4. قم بإزالة السائل من الأنبوب باستخدام ماصة دقيقة. تجنب ملامسة جدار الأنبوب حيث تشكلت حبيبات الجسيمات النانوية.
   5. أضف 250 ميكرولتر من محلول الغسيل الطازج. حافظ على الأنبوب تحت التحريض لمدة 15 دقيقة.
   6. كرر الخطوات 3.1.3.-3.1.5. 2x أكثر ، اهتزاز لمدة 5 دقائق فقط.
   7. أضف التركيز المطلوب من الجسم المضاد الأولي المضاد لليزوزيم (انظر جدول المواد). اضبط على الحجم النهائي البالغ 100 ميكرولتر في مخفف الأجسام المضادة (1x TBS ، 1٪ BSA ، 0.05٪ Tween 20).
   8. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استمر في الرج لمدة 15 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة.
   9. كرر خطوات الغسيل 3.1.2.-3.1.6.
   10. أضف 100 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة. أضف الجسم المضاد الثانوي المقترن ببيروكسيداز الفجل الحار (HRP-AbII) (انظر جدول المواد) عند تخفيف 1: 500.
   11. كرر خطوات الغسيل 3.1.2.-3.1.6.
   12. احتفظ بالجسيمات النانوية في حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة.

4. التركيب التجريبي

1. املأ المحاقن الزجاجيتين سعة 100 ميكرولتر بالماء ، وقم بتوصيل خرطوم بطول 6.5 سم بكل حقنة ، وأدخل دبوسا معدنيا في نهاية الخرطوم ، ثم ضع كلا المحاقن على مضخة الحقنة التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر.
2. أغلق جميع خراطيم جهاز الأكريليك بالحرارة.
3. قطع خرطوم المدخل واحتفظ فقط ببضعة ملليمترات. املأ إبرة الاستغناء بمحلول غسيل وأدخلها في خرطوم القطع. اترك المحلول بالتنقيط قبل توصيل الإبرة بالجهاز لمنع وصول الهواء إلى الجهاز.
4. قطع خرطوم المخرج من القناة الجانبية. قم بتوصيله بمضخة المحقنة. بعد ذلك ، قم بنفس الإجراء لخرطوم مخرج القناة الرئيسية.
   ملاحظه: من المهم تنفيذ الخطوات 4.3.-4.4. في هذا الترتيب لتجنب تفريغ مصيدة الجسيمات الدقيقة. إذا أمكن ، تحقق من حالة المصيدة خلال هذه الخطوات بمساعدة عدسة مكبرة.
5. ضع شريحة زجاجية على مرحلة المجهر. قم بتوصيل المغناطيس بالشريحة بشريط على الوجهين وضع قطعة صغيرة من الشريط على كل جانب لتثبيت حواف الشريحة على الزجاج.
6. قم بتعيين معدل تدفق يبلغ 50 ميكرولتر / ساعة من خلال علامتي التبويب معدل التدفق والوحدات في وحدة التحكم في مضخة الحقنة. حدد وضع السحب وانقر فوق الزر "ابدأ" لتنشيط تدفق مخزن الغسيل.
7. بعناية ، اقترب من الجهاز باتجاه الشريحة باستخدام المغناطيس بطريقة أفقية بحيث تتصل منطقة الشريحة التي تحتوي على المصيدة بالمغناطيس.
8. قم بلصق حواف الجهاز بالزجاج بشريط لاصق على الوجهين لمنع الحركة. تجنب إعاقة المسار البصري للفحص المجهري (الشكل 1 ج).

1. حافظ على تدفق مخزن الغسيل المؤقت لمدة 10 دقائق عند 50 ميكرولتر / ساعة لإزالة BSA الزائد.
2. قم بإزالة عازلة الغسيل المتبقية من إبرة الاستغناء باستخدام ماصة دقيقة. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الجسيمات النانوية.
3. قم بتدفق تعليق الجسيمات النانوية لمدة 7 دقائق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة. بعد ذلك ، قم بتغيير معدل التدفق إلى 50 ميكرولتر / ساعة والتدفق لمدة 15 دقيقة أخرى.
4. قم بتغيير إبرة الاستغناء. قم بتدفق مخزن الغسيل المؤقت لمدة 10 دقائق عند 50 ميكرولتر / ساعة. قم بإعداد الركيزة الفلورية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة أثناء خطوة الغسيل.
5. قم بإزالة عازلة الغسيل المتبقية من إبرة الاستغناء باستخدام ماصة دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من الركيزة الفلورية (انظر جدول المواد). قم بتدفق الركيزة الفلورية لمدة 6 دقائق عند 50 ميكرولتر / ساعة.
6. اضبط معدل التدفق (1 ميكرولتر / ساعة ، 3 ميكرولتر / ساعة ، 5 ميكرولتر / ساعة ، و 10 ميكرولتر / ساعة) ومعلمات قياس الوقت (6 دقائق) في معدل التدفق المقابل وعلامات تبويب ضبط المؤقت للواجهة التي تتحكم في مضخة الحقنة. تأكد من تحديد وضع السحب لكل من القياسات التي سيتم إجراؤها.
7. اضبط علامة تبويب معدل التدفق الإضافية على 50 ميكرولتر / ساعة واضبط المؤقت على 3 دقائق لخطوة الغسيل.
8. قم بتشغيل مضان المجهر قبل 15 ثانية من توقف الركيزة عند 50 ميكرولتر / ساعة. ابدأ التقاط الصورة باستخدام برنامج كاميرا المجهر 10 ثوان قبل توقف الركيزة بوقت تعرض يبلغ 1,000 مللي ثانية. قم بإجراء التصوير لمدة 6 دقائق بمعدل 1 إطار/ثانية (FPS).
9. انقر فوق الزر "ابدأ" لمعلمة معدل التدفق المطلوبة مباشرة بعد توقف معدل تدفق غسل الركيزة عند 50 ميكرولتر / ساعة. انقر فوق الزر "ابدأ" الخاص بتدفق الغسيل (50 ميكرولتر / ساعة) مباشرة بعد توقف تدفق القياس المحدد.
10. أوقف التقاط الصورة وقم بإيقاف تشغيل مضان المجهر لتجنب التبييض الضوئي للركيزة.
11. كرر الخطوات 5.8.-5.10. لكل معدل تدفق قياس مستخدم.

الشكل 1: التكوين النهائي للجهاز. (أ) جهاز أكريليك مع خراطيم متصلة بالمدخلات والمخرجات المقابلة. يوضح المقياس أبعاد الجهاز بالسنتيمتر. (ب) بروتوكول تكوين مصيدة الجسيمات الدقيقة. تتدفق الجسيمات الدقيقة عبر القناة عن طريق الجاذبية عندما يتم وضع الجهاز في وضع رأسي. تتركز الجسيمات الدقيقة عند تقييد 5 ميكرومتر. تتم إزالة الجسيمات الدقيقة الزائدة بسهولة عن طريق تدوير الشريحة عبر القناة الجانبية. يتم الاحتفاظ بالشريحة عمودية للحفاظ على المصيدة قبل المقايسة المناعية. (ج) جهاز الموائع الدقيقة المثبت على شريحة زجاجية تحتوي على المغناطيس ، على مسرح المجهر الفلوري المقلوب. لوحظت إبرة الاستغناء التي تتم من خلالها إضافة الكواشف ، وكذلك خراطيم المخرج التي تتصل بمضخة حقنة.

الشكل 2: فصل الجسيمات النانوية. باستخدام فاصل مغناطيسي تجاري ، يمكن تركيز الجسيمات النانوية 100 نانومتر بسهولة لأداء خطوات الغسيل أثناء المقايسة المناعية. لوحظت الحبيبات التي تشكلت بعد 15 دقيقة في الدائرة الحمراء.