$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ملاحظة: تم استخدام خط خلايا سرطان المبيض ، OVCAR3 ، في هذه الخطوات ، ولكن هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع على العديد من خطوط الخلايا الأخرى ، بما في ذلك تلك المشتقة من مصادر غير المبيض. يظهر مخطط للبروتوكول في الشكل 1.
< p class = "jove_title" >
1. طلاء الخلايا
- اصنع أغطية مطلية ب poly-L-lysine.
- أضف أغطية معقمة بقطر 12 مم إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل بمحلول بولي إل ليسين ، وضعها على كرسي هزاز لمدة 15 دقيقة.
- استنشق المحلول في غطاء مزرعة الأنسجة. اغسل الغطاء بإضافة ماء معقم وضع الأنبوب الذي يحتوي على الغطاء مرة أخرى على الروك لمدة 5 دقائق. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات.
- انشر الغطاء المطلي على طبق معقم واستنشق أي ماء متبقي. اترك الغطاء يجف في شفاط زراعة المناديل لمدة 1 ساعة أو حتى تختفي قطرات الماء. بمجرد أن يجف ، أغلق الطبق بالبارافيلم ، وضعه على حرارة 4 درجات مئوية.
- ضع غطاء واحد مطلي ببولي L-lysine في كل بئر من صفيحة 24 بئرا. يعد استخدام أغطية بولي ليسين أمرا بالغ الأهمية لمنع انفصال الخلايا عن الغطاء أثناء خطوة الاستخراج المسبق.
- قم بتربسين خلايا OVCAR3 بمجرد وصولها إلى 70٪ -80٪ من التقاء.
- لتربسين طبق مزرعة مقاس 10 سم متقارب بنسبة 70٪ -80٪ ، قم بشفط الوسط من الطبق ، واغسله ب 5-7 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS).
- قم بشفط PBS ، وأضف 1 مل من 0.25٪ التربسين ، وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 8-10 دقائق ، أو حتى ترفع الخلايا من قاع الطبق.
- اجمع الخلايا ب 5-10 مل من الوسط وأضفها إلى أنبوب مخروطي الشكل.
- عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم باستخدام الإجراءات القياسية.
- قم بعمل تخفيف 25,000 خلية / مل وأضف 1 مل من الخلايا على أغطية poly-L-lysine الموضوعة في آبار ألواح 24 بئرا. بالنسبة لأي خط خلوي آخر ، حدد رقما بحيث تكون الخلايا حوالي 70٪ -80٪ ملتقية بعد ثلاث مضاعفات للسكان.
- تنمو الخلايا في وسط الثقافة في ظل الظروف القياسية.
< p class = "jove_title" >
2. الخلايا النابضة باستخدام IdU
- لكي تنتشر الخلايا بشكل صحيح على الغطاء ، يكفي مضاعفة مجموعة واحدة. بعد مضاعفة مجموعة سكانية واحدة ، نبض الخلايا ب 10 ميكرومتر 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) (انظر جدول المواد حول كيفية إعادة تكوين IdU) لمضاعفة السكان اللاحقتين.
ملاحظه: لقد جربنا نظائر مختلفة من الثايميدين ، بما في ذلك برومودوكسيوريدين (BrdU) و 5-chloro-2′-deoxyuridine (CIdU) و IdU. من بين النظائر الثلاثة ، يعطي IdU أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء. تظهر الصور المقارنة للخلايا النبضية مع نظائرها الثلاثة المختلفة في الشكل 2. نوصي باستخدام عنصرين من عناصر التحكم السلبية: (1) عينة نبضية بدون IdU ، و (2) عدم التحكم في الأجسام المضادة الأولية. إذا كان تكوين ssDNA بحاجة إلى تقييم بسبب علاج معين ، فإننا نوصي بإضافة الدواء بعد الجولة الأولى من مضاعفة IdU.
- بعد النبض باستخدام IdU لمضاعفة عدد السكان ، احصد الخلايا للتصوير.
- استبدل الوسط بمثلج بارد 0.5٪ PBSTx (PBS + 0.5٪ Triton X-100) على الثلج لمدة 5 دقائق. تساعد خطوة الاستخراج المسبق هذه على إطلاق البروتينات السيتوبلازمية وغير المرتبطة بالكروماتين ، مما يترك البروتينات المرتبطة بالكروماتين سليمة. يمكن أن تتقشر بعض خطوط الخلايا بسهولة أثناء الاستخراج المسبق. في مثل هذا السيناريو ، يمكن للمرء استخدام 0.5٪ CSK (أنابيب 10 ملي مولار (درجة الحموضة 6.8) ، 100 ملي كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، 300 ملي مولار سكروز ، 3 ملي كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) ، 1 ملي مولار حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين جلايكول (EGTA) و 0.5٪ تريتون X-100).
< p class = "jove_title" >
3. التثبيت
- استنشق PBSTx واحتضنه لمدة 15 دقيقة مع 3٪ بارافورمالدهيد (PFA) (جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بثلاث إلى أربع غسلات مع 1x PBS. يمكن الاحتفاظ بالخلايا الثابتة عند 4 درجات مئوية حتى خطوات أخرى. < / >
تنبيه: PFA شديد السمية ومسرطنة. تجنب ملامسة الجلد والعينين والأغشية المخاطية. قم بتنفيذ جميع الخطوات باستخدام PFA في غطاء الدخان ، وتخلص من المواد بشكل صحيح.
4. النفاذية والحجب
- بعد التثبيت ، قم باختراق الخلايا باستخدام 0.5٪ PBSTx على الجليد لمدة 5 دقائق. استخدم حجما كافيا لتغطية الغطاء بالكامل (عادة بين 500 ميكرولتر و 1 مل).
- اغسل الخلايا ثلاث إلى أربع مرات باستخدام 0.2٪ PBST (1X PBS + 0.2٪ Tween-20) في درجة حرارة الغرفة. مل واحد من PBST يكفي لغسل كل بئر. قم بإجراء عمليات الغسيل المتتالية دون أي حضانات.
- قم بشفط PBST وحظر العينات باستخدام زلاليم مصل البقر بنسبة 5٪ ، BSA (جدول المواد) المصنوع في 1x PBS (مانع عازل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
< p class = "jove_title" >
5. التلوين المناعي بالجسم المضاد IdU
- للتلوين المناعي ، قم بإعداد غرفة رطبة (منشفة ورقية مبللة على Tupperware مسطحة القاع). قم بتغطية غطاء اللوحة المكونة من 24 بئرا بالبارافيلم ، وضعها في الغرفة المرطبة ، وضع الغطاء على غطاء اللوحة.
- قم بإعداد الجسم المضاد للفأر الأساسي المضاد ل BrdU (جدول المواد) عن طريق تخفيفه 1: 200 في المخزن المؤقت للحجب من الخطوة 4.2. ثبت سابقا أن الجسم المضاد المضاد ل BrdU يكتشف IdU.
- أضف 60 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة IdU في الجزء العلوي من الغطاء. احتضان الغطاء لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- بدلا من ذلك ، استخدم محلول أقل للأجسام المضادة إذا تم قلب الغطاء على قطرة (20-25 ميكرولتر) من تخفيف الأجسام المضادة 1: 200 الماصة على البارافيلم هذا يقلل أيضا من احتمالية جفاف المحلول أثناء الحضانة.
- بعد حضانة 1 ساعة ، استنشق الجسم المضاد الأساسي. أعد الغطاء مرة أخرى إلى طبق مكون من 24 بئرا ، واغسلها أربع مرات باستخدام 0.2٪ PBST.
- بالنسبة للجسم المضاد الثانوي، استخدم نفس الغرفة المرطبة الموضحة في الخطوة 5.1. تمييع الجسم المضاد الثانوي المترافق المضاد للفأر (جدول المواد) في المخزن المؤقت المانع (1: 200). أضف 60 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي إلى الغطاء ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 1 ساعة ، وهذا الجسم المضاد الثانوي حساس للضوء.
- استنشاق الجسم المضاد الثانوي. أعد الغطاء مرة أخرى إلى اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واغسلها أربع مرات باستخدام 0.2٪ PBST.
- قم بتسمية شرائح المجهر ، وقم بتركيب الطبقات على الشرائح باستخدام وسط تركيب 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (جدول المواد). قم بتخزين الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. يوصى بالحضانة لمدة 24 ساعة إذا كان وسط التركيب بحاجة إلى المعالجة أو التصلب. < / >
ملاحظه: يمكن بعد ذلك تخزين الشرائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل تصويرها على المجهر الفلوري. تظهر صورة تمثيلية في الشكل 3.
