تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
فئة
1. تصنيع وتخزين الرقائق المفاجئة
- طريقة النقل الفردي (الشكل 1 أ)
- محاليل cAb الموضعية التي تحتوي على 400 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة و 20٪ من الجلسرين في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) على شريحة فحص النيتروسليلوز (أو الزجاج الوظيفي) مع نصاب المصفوفة الدقيقة النافثة للحبر عند رطوبة نسبية تبلغ 60٪ (1.2 نانو لتر لكل بقعة) مع تباعد 800 ميكرومتر من المركز إلى المركز. تأكد من تثبيت الشريحة على سطح المراقب وفقا لزاوية واحدة (هنا ، تم استخدام الزاوية اليسرى السفلية).
- احتضان شريحة الفحص المرقطة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع رطوبة نسبية تبلغ 60٪.
- قم بتثبيت حشية وحدة منزلقة مع 16 مقصورة على شريحة الفحص لتقسيمها إلى 16 بئرا. اشطف الشريحة ثلاث مرات عن طريق إضافة 80 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.1٪ Tween-20 (PBST) في كل بئر ، ورجها عند 450 دورة في الدقيقة على شاكر ، 5 دقائق في كل مرة.
- أضف 80 ميكرولتر من محاليل المانع لكل بئر ورجه لمدة ساعة واحدة عند 450 دورة في الدقيقة.
- قم بإزالة الحشية وجفف شريحة الفحص بتيار من النيتروجين.
- قم بإصلاح شريحة نقل على سطح المراقب وادفع الزاوية اليسرى السفلية من الشريحة مقابل الزاوية اليسرى السفلية من سطح النصاب. تكتشف النافثة للحبر مجموعة من علامات المحاذاة (محلول من حبات البوليسترين الدقيقة) بنفس تخطيط الأجسام المضادة الملتقطة (cAbs).
- دع علامات المحاذاة تجف. اقلب شريحة النقل وأعدها إلى سطح المراقب ، وثبتها في الزاوية اليسرى السفلية.
- تحضير محاليل اكتشاف الأجسام المضادة للكشف (dAb) التي تحتوي على 20 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة و 20٪ من الجلسرين و 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA).
- باستخدام كاميرا المراقب، التقط صورة لعلامة محاذاة. قم بتنفيذ هذه الصورة في برنامج الإكتشاف كإيمانية واحصل على نظام التعرف على الصور لنصاب نفث الحبر لتحديد العلامة اليسرى العلوية. استخدم إحداثياته كنقطة أولى في مصفوفة dAb. بقعة 8 نانولتر لكل قطرة مع تباعد من المركز إلى المركز يبلغ 800 ميكرومتر.
- طريقة النقل المزدوج (الشكل 1 ب)
- ضع شريحة النقل 1 على سطح نصاب نفث الحبر مقابل الزاوية اليسرى السفلية. بقعة محاليل cAbs التي تحتوي على 400 ميكروغرام / مل أجسام مضادة ، و 20٪ جلسرين ، و 1٪ BSA في PBS على الشريحة باستخدام مراقب مصفوفة دقيقة نافثة للحبر عند رطوبة نسبية تبلغ 60٪ (0.4 نانولتر لكل بقعة وقطر ~ 200 ميكرومتر). التباعد من المركز إلى المركز هو 400 ميكرومتر.
- التقط شريحة النقل بشريحة فحص مطلية بالنيتروسليلوز (أو زجاج وظيفي) باستخدام جهاز المفاجئة (الشكل 2) لنقل قطرات cAb إلى شريحة الفحص.
- أدر جميع الأزرار الستة الموجودة على جانب جهاز المفاجئة بمقدار 90 درجة لسحب وقفل جميع الغطاسات في وضع الفتح. أدخل شريحة النقل في حامل الشريحة في الوعاء الخاص به بحيث تكون الزاوية المقطوعة في مواجهة دبوس البوجو الثابت. أدر المجموعة الأولى المكونة من ثلاثة أزرار لتحرير الغطاسات باستخدام دبوس البوجو الذهبي وتأكد من دفع الشرائح مقابل دبابيس المحاذاة.
- أدخل شريحة مطلية بالنيتروسليلوز في الجهاز المفاجئ رأسا على عقب جالسة على 4 دبابيس بوجو. أدر المجموعة الثانية المكونة من ثلاثة أزرار لتحرير الغطاسات باستخدام الدبوس الفضي وتأكد من دفع الشرائح مقابل دبابيس المحاذاة.
- أغلق جهاز المحاذاة عن طريق وضع الغلاف العلوي على حامل الشريحة باستخدام أعمدة المحاذاة والفتحات للحصول على تحديد المواقع بدقة.
- أدخل جهاز المفاجئة المغلق في قفصه وادفع لسان الإغلاق لأسفل تماما لجعل المصفوفات الدقيقة وجها لوجه أثناء الضغط المناسب. يحفظ مغلقا لمدة 1 دقيقة.
- افصل بين الشرائح. احتضان شريحة الفحص في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع رطوبة نسبية 60٪. اغسل شريحة الفحص وحظرها وجففها كما هو موضح في الخطوات 1.1.3 - 1.1.5.
- ضع شريحة نقل أخرى على سطح نصاب نفث الحبر وادفع إلى الزاوية اليسرى السفلية. تحتوي محاليل dAb الموضعية على 50 أو 100 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة (انظر الجدول 1) ، و 20٪ جلسرين ، و 1٪ BSA في PBS. تأكد من أن كل بقعة هي 0.8 نانولتر وأن التباعد من المركز إلى المركز بين البقع هو 400 ميكرومتر.
- قم بتخزين الفحص وشريحة النقل. أغلق شرائح الفحص والنقل في كيس محكم الغلق يحتوي على مادة مجففة وضعها في فريزر -20 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >
2. المقايسات المناعية المتعددة مع رقائق المفاجئة
- استرجع شريحة الفحص من الفريزر. اترك الكيس مغلقا لمدة 30 دقيقة حتى تصل الشريحة إلى درجة حرارة الغرفة.
- قم بإعداد محاليل العينات المخففة التسلسلية المكونة من 7 نقاط عن طريق زيادة البروتينات في PBS التي تحتوي على 0.05٪ Tween-20. < / >
ملاحظه: هنا ، يتم استخدام عامل تخفيف 5 أضعاف. يتم سرد تركيزات البداية لكل بروتين في الجدول 1.
- قم بإعداد حلول العينة حسب الاقتضاء. على سبيل المثال ، قم بتخفيف المصل البشري 4 مرات في المخزن المؤقت PBST.
- قم بتثبيت حشية مكونة من 16 حجرة على شريحة الفحص.
- املأ عمودا واحدا من 8 آبار ب 7 محاليل لتخفيف البروتين ومحلول عازلة PBST خال من البروتين عن طريق سحب العينات. ماصة محاليل العينة في 8 آبار أخرى على نفس الشريحة.
ملاحظة: يمكن تركيب محاليل 80 ميكرولتر في كل بئر. يمكن استخدام المزيد من الشرائح لقياس عينات إضافية عند الضرورة.
- احتضان العينات على شاكر عند 450 دورة في الدقيقة إما لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الشريحة ثلاث مرات باستخدام PBST على الخلاط عند 450 دورة في الدقيقة ، 5 دقائق في كل مرة. قم بإزالة الحشية وجفف الشريحة تحت تيار من غاز النيتروجين.
- استرجع شريحة النقل باستخدام dAbs من الفريزر. احتفظ بالحقيبة مغلقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضن الشريحة في غرفة مغلقة (مثل صندوق الأطراف الفارغ) تحتوي على 60٪ حبات تثبيت الرطوبة لمدة 20 دقيقة لإعادة الجفاف.
- قم بمحاذاة شريحة النقل بشريحة الفحص باستخدام جهاز المفاجئة (الشكل 2) لنقل قطرات dAb. انظر القسم 1.2.2 لتشغيل جهاز المفاجئة.
- افصل بين الشرائح. احتضان شريحة الفحص في غرفة مغلقة تحتوي على 60٪ حبات تثبيت الرطوبة لمدة 1 ساعة. قم بتثبيت شريحة الفحص بحشية مكونة من 16 حجرة واشطف الشريحة 4 مرات باستخدام PBST على شاكر عند 450 دورة في الدقيقة ، 5 دقائق في كل مرة.
- الماصة 80 ميكرولتر من المحاليل التي تحتوي على 2.5 ميكروغرام/مل من الستربتافيدين فلوروفور في PBS في كل بئر. احتضن لمدة 20 دقيقة على شاكر عند 450 دورة في الدقيقة.
- اشطف الشريحة 3 مرات باستخدام PBST ومرة واحدة بالماء المقطر على الخلاط عند 450 دورة في الدقيقة. قم بإزالة الحشية وجفف الشريحة باستخدام غاز النيتروجين.
< p class = "jove_title" >
3. مسح الشرائح وتحليل البيانات
- امسح شريحة الفحص ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي للمصفوفة الدقيقة الفلورية باستخدام ليزر 635 نانومتر.
- استخرج الكثافة الصافية لكل بقعة باستخدام برنامج تحليل (مثل محلل array-pro).
- احسب حد الكشف (LOD) لكل بروتين باستخدام برنامج إحصائي وحدد تركيزات البروتين في العينات.
ملاحظه: يتم تعريف LOD على أنه تقاطع Y للمنحنى القياسي يزداد بمقدار ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري لثلاثة فحوصات مستقلة.
< p class = "jove_content" >
الجدول 1. تركيزات البروتين و LODs في المخزن المؤقت من مقايسة 50-plex. يوجد LOD ل CA 15-3 في U / مل (*).
اسم البروتين
تركيز البدء (نانوغرام / مل)
LOD (pg / مل)
اسم البروتين
تركيز البدء (نانوغرام / مل)
LOD (pg / مل)
ANG2
500 جنيه
1.3 × 10
4
IL-6
ب
1
2.1 × 10
2
BDNF
500 جنيه
1.0 × 10
2
IL-5
50
77
CA 15-3*
1
4.9 × 10
3
IL-4
1000
1.5 × 10
4
CEA
1000
5.4 × 10
3
IL-2
50
76
CXCL10 / IP-10
50
1.7 × 10
2
ليب
200 ريال
4.0 × 10
2
CRP
200 ريال
44
ميج
500 جنيه
11 × 10
2
المهندس
1000
6.2 × 10
2
CCL3 / MIP-1α
50
3.3
EGF
50
1.8 × 10
2
CCL4 / MIP-1β
50
12
المصرة المصرية
200 ريال
1.9 × 10
2
MMP-3
500 جنيه
1.0 × 10
2
فاس - ل
500 جنيه
4.5 × 10
2
M-CSF
500 جنيه
8.2 × 10
3
FGF
500 جنيه
1.0 × 10
3
MMP-9
200 ريال
3.1 × 10
2
جي - CSF
500 جنيه
39
CCL2 / MCP-1
50
55
GM-CSF
50
3.8
NCAM-1
500 جنيه
1.7 × 10
3
الإجمالية α
50
3.0 × 10
2
β-NGF
200 ريال
1.4 × 10
3
HER2
500 جنيه
3.5 × 10
3
NT-3
200 ريال
5.8 × 10
2
PDGF-BB
200 ريال
73
المرجع التشغيلي
500 جنيه
1.9 × 10
3
IL-1β
500 جنيه
7.9 × 10
2
RBP4
200 ريال
1.2 ×10
2
IL-1ra
200 ريال
1.1 × 10
3
سبارك
1000
4.6 ×10
4
IL-15
50
8.2 × 10
2
TNF-α
50
4.4
IL-12
1
30
TNF-RI
50
1.3 × 10
2
IL-11
500 جنيه
1.2 × 10
3
TNF-RII
50
12
IL-10
500 جنيه
6.1 ×10
2
FAS / TNFRSF6
200 ريال
2.8 ×10
2
IL-8
50
6.6
uPA
200 ريال
24
IL-7
2.5
26
uPAR (CD87)
200 ريال
76
IL-6
أ
1000
84
فيجف
200 ريال
6.7 × 10
2
