طريقة تللوين مناعي متعددة الإرسال باستخدام الأجسام المضادة الأولية من نفس الأنواع المضيفة

الملخص

المصدر: Lyu, Q., et al. الميكروويف والفلوروفور تيراميد للتلوين المناعي المتعدد على الغدة الكظرية للفأر - باستخدام الأجسام المضادة الأولية غير المترافقة من نفس الأنواع المضيفة. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو فحصا لإجراء تلطيخ مناعي متعدد الإرسال باستخدام الأجسام المضادة الأولية من نفس الأنواع المضيفة. في هذه الطريقة ، يخضع قسم أنسجة الغدة الكظرية لعملية تلطيخ مناعي من خطوتين. في البداية ، يتم تلطيخ القسم بأجسام مضادة خاصة بعلامات في القشرة ، متبوعا بتجريد الجسم المضاد المرتبط وإعادة تلطيخه بالأجسام المضادة الخاصة بالعلامات في النخاع.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تلطيخ بالجسم المضاد الأول

1. إزالة الشمع وإعادة ترطيب شرائح البارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE) مع تخصيص 5 دقائق لكل خطوة من الخطوات التالية: الزيلين أو الكواشف المكافئة 3x ، 100٪ إيثانول 2x ، 95٪ إيثانول 1x ، 70٪ إيثانول 1x ، 50٪ إيثانول 1x ، والماء المقطر 2x.
   ملاحظه: يجب أن تظل الشرائح رطبة بدءا من خطوة إعادة الجفاف هذه حتى التركيب في الخطوة النهائية.
2. لاسترجاع المستضد الاختياري ، ضع الشرائح في 275 مل من محلول سترات الصوديوم المغلي (10 ملي مولار ، الرقم الهيدروجيني = 6.0) لمدة 8 دقائق. للحفاظ على غليان المحلول ، ضع الشرائح بشكل مسطح في الجزء السفلي من صندوق طرف ماصة^{مقاس 14} × 9.5 × 9 سم (العرض × الطول × الارتفاع) مع غطاء وقم بتسخين المحلول في الميكروويف على طاقة 70٪ في فرن ميكروويف 700 واط لمدة 8 دقائق. ثم أخرج صندوق طرف الماصة من فرن الميكروويف ، وافتح الغطاء ، واترك المحلول يبرد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة على الأقل.
3. انقل الشرائح إلى وعاء Coplin يحتوي على PBST (محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 0.1٪ بولي سوربات 20/80). يغسل باستخدام PBST لمدة 5 دقائق و 3 أضعاف. إذا لم تنتقل على الفور إلى الخطوة التالية ، فقم بتخزين الشرائح في هذه الخطوة باستخدام PBST في جرة Coplin في RT لبضع ساعات أو عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أيام إذا لم تنتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
4. لتحضير محلول الانسداد ، استخدم المصل الطبيعي للأنواع المضيفة للجسم المضاد الثانوي ككاشف مانعب. يمكن أيضا استخدام كواشف حجب تجارية أخرى. في حالة استخدام مصل عادي يستخدم في الدراسة المعروضة في هذه الدراسة ، أضف 100 ميكرولتر من مصل الحمار العادي إلى 4.9 مل من PBST. يمكن تخزين محلول الحجب عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
5. للحظر ، تخلص من PBST من الشرائح وقم بتغطيتها بسرعة بمحلول حظر كاف. احتضن الشرائح في RT في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة.
6. تحضير محلول الجسم المضاد الأساسي (500 ميكرولتر لشريحتين) باستخدام محلول الحجب لتخفيف الجسم المضاد الأساسي إلى التركيز المطلوب. يجب تخزين المحلول على الثلج حتى الاستخدام.
   1. بالنسبة لنازعة هيدروجين 3β-hydroxysteroid (3βHSD) ، أضف 2 ميكرولتر من الجسم المضاد 3βHSD إلى 498 ميكرولتر من محلول الحظر.
   2. بالنسبة لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، أضف 0.5 ميكرولتر من الجسم المضاد TH إلى 499 ميكرولتر من محلول الحظر.
   3. بالنسبة إلى β-catenin، أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد β-catenin إلى 499 ميكرولتر من محلول الحظر.
   4. بالنسبة لنازعة هيدروجين 20α-hydroxysteroid (20αHSD) ، أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد 20αHSD إلى 499 ميكرولتر من محلول الحظر.
   5. بالنسبة للسيتوكروم P450 2F2 (CYP2F2) ، أضف 2 ميكرولتر من الجسم المضاد CYP2F2 إلى 498 ميكرولتر من محلول الحظر.
7. احتضان الجسم المضاد الأساسي عن طريق التخلص من محلول الانسداد من الشرائح ، وتغطيتها بسرعة بمحلول الأجسام المضادة الأولية الكافية. احتضان الشرائح في غرفة رطبة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. أثناء الحضانة ، قد يتم تغطية الشرائح بقطعة صغيرة من فيلم البارافين لمنع الجفاف.
8. في صباح اليوم التالي ، اغسل الشرائح باستخدام PBST لمدة 5 دقائق و 3 أضعاف.
9. تحضير محلول الجسم المضاد الثانوي (500 ميكرولتر لشريحتين) باستخدام محلول الحجب لتخفيف الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل إلى التركيز المطلوب (على سبيل المثال ، 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للفأر للحمار أو الجسم المضاد للأرانب الحمار إلى 499 ميكرولتر من محلول الحظر). يجب تخزين المحلول على الثلج حتى الاستخدام.
10. احتضان الجسم المضاد الثاني عن طريق التخلص من PBST من الشرائح وتغطيتها بسرعة بمحلول كاف للأجسام المضادة الثانوية. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة في RT.
    ملاحظه: إذا كان البيوتين الداخلي مصدر قلق ، فاستخدم جسما مضادا ثانويا مترافقا بالبيروكسيداز بدلا من الجسم المضاد الثانوي الحيوي. انتقل إلى الخطوة 1.14 في حالة استخدام جسم مضاد ثانوي مترافق مع البيروكسيداز في الخطوة 1.10.
11. اغسل الشرائح باستخدام PBST لمدة 5 دقائق و 3 مرات.
12. تحضير محلول الستربتافيدين المترافق ببيروكسيداز الفجل الحار (SA-HRP) (500 ميكرولتر لشريحتين) عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من SA-HRP إلى 499 ميكرولتر من PBS. التركيز النهائي هو 1 ميكروغرام / مل.
13. احتضن مع حل SA-HRP. تخلص من PBST من الشرائح وقم بتغطية الشرائح بسرعة بحل SA-HRP الكافي. احتضان الشرائح في غرفة مرطبة لمدة 0.5 ساعة في RT.
14. اغسل الشرائح باستخدام PBST لمدة 5 دقائق و 3 مرات.
15. قم بإعداد محلول الفلوروفور التيراميد عن طريق تخفيف الفلوروفور التيراميد بمخزن التخفيف الخاص به وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (على سبيل المثال ، 5 ميكرولتر من الفلوروفور التيراميد إلى 496 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف).
16. قم بإجراء تطوير الإشارة باستخدام فلوروفور التيراميد عن طريق التخلص من PBST من الشرائح وتغطية الشرائح بسرعة بمحلول فلوروفور تيراميد كاف. احتضان في غرفة رطبة لمدة 1 دقيقة في RT. يمكن تعديل وقت الحضانة للحصول على شدة التألق المطلوبة. أوقف التفاعل عن طريق نقل الشرائح إلى جرة Coplin تحتوي على PBST. اغسل الشرائح باستخدام PBST لمدة 3 دقائق 2x.
17. يمكن فحص الإشارات بسرعة تحت المجهر الفلوري لتأكيد النتيجة في هذه المرحلة. إذا لم يتم استخدام أغطية ، ضع قطرة من الجلسرين: PBS (1: 1) على كل قسم للحفاظ على رطوبة العينات. اغسل الشرائح باستخدام PBST لمدة 3 دقائق 2x. يمكن تخزين الشرائح في PBST عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

< p class = "jove_title" >2. قم بتجريد الجسم المضاد الأول

1. ضع الشرائح في 275 مل من محلول سترات الصوديوم المغلي (10 ملي مولار ، الرقم الهيدروجيني = 6.0) لمدة 8 دقائق على الأقل. حافظ على غليان المحلول عن طريق وضع الشرائح بشكل مسطح في قاع صندوق طرف ماصة مقاس 14 × 9.5 × 9 سم 3 (العرض × الطول × الارتفاع) مع غطاء ووضع المحلول في الميكروويف على طاقة 70٪ في فرن ميكروويف 700 واط لمدة 8 دقائق. إذا كان من المفضل وقت تجريد أطول ، فقد يكون من الضروري إزالة المخزن المؤقت باستخدام محلول سترات الصوديوم المغلي للحفاظ على الشرائح مغمورة في محلول عازل في جميع الأوقات. أخرج صندوق طرف الماصة من فرن الميكروويف ، وافتح الغطاء ، واترك المحلول يبرد عند RT لمدة 20 دقيقة على الأقل.
2. انقل الشرائح إلى برطمان كوبلين يحتوي على PBST. يغسل باستخدام PBST لمدة 5 دقائق و 3 أضعاف. إذا لم يتم تنفيذ الخطوة التالية على الفور ، فقم بتخزين الشرائح في وعاء Coplin مع PBST في RT لبضع ساعات أو عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أيام.

< p class = "jove_title" >3. وصمة عار بالجسم المضاد الثاني

1. ابدأ من خطوة الحظر واتبع نفس الإجراءات في الخطوة 1.5 حتى الخطوة 1.14. في خطوات تطوير الإشارة (الخطوة 1.15 والخطوة 1.16) ، استخدم الفلوروفور التيراميد في طيف مضان مختلف.
   ملاحظه: يمكن تجريد الشرائح باستخدام هذه الطريقة عدة مرات للسماح بالتلوين المتعدد. لا يتطلب الجسم المضاد الأخير فلوروفور تيراميد كمراسل. يمكن استخدام الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور لإظهار إشارات من آخر جسم مضاد أولي.
2. احتضان الشرائح مع 2 ميكروغرام / مل 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) أو محلول Hoechst لمدة 1 دقيقة في RT إذا كانت هناك حاجة إلى تلطيخ مضاد للنواة. ثم اغسل الشرائح باستخدام PBST لمدة 3 دقائق 2x.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مضاد للتلاشي تصاعد الوسط مختبرات ناقلات إتش -1000 الحمار البيوتينيل المضاد للفأر جاكسون إيمونو 715-066-151 1: 500 التخفيف الحمار البيوتينيل المضاد للأرانب جاكسون إيمونو 711-066-152 1: 500 التخفيف دابي بيو ليجند 422801 2 ميكروغرام / مل في الماء المقطر المجهر الفلوري دوي يدور 4 ستربتافيدين بيروكسيداز المترافق بالفجل جاكسون إيمونو 016-030-084 1: 1000 تخفيف فرن ميكروويف، 700 واط جنرال إلكتريك JEM3072DH1BB ماوس مضاد ل CYP2F2 سانتا كروز, الطراز SC-374540 1: 250 التخفيف الماوس المضاد ل TH سانتا كروز, SC-25269 1: 1000 تخفيف مصل الحمار العادي جاكسون إيمونو 017-000-121 مصل 2٪ في PBST أرنب مضاد ل 20α HSD كيرافاست، هب4002 1: 500 التخفيف أرنب مضاد ل 3βHSD متحول جينيك، KO607 1: 250 التخفيف أرنب مضاد TH نوفوس NB300-109 1: 1000 تخفيف أرنب مضاد β catenin أبكام، أب32572 1: 500 التخفيف ستربتافيدين بيروكسيداز الفجل الحار (SA-HRP) جاكسون إيمونو 016-303-084 1: 1000 تخفيف TSA Cy3 تيراميد بيركين إلمر SAT704B001EA 1: 100 التخفيف TSA فلورسين تيراميد بيركين إلمر SAT701001EA 1: 100 التخفيف