التصوير المناعي المتعدد الإرسال لتحليل مجموعات الخلايا التائية المقاومة للعلاج المناعي

الملخص

المصدر: Granier ، C. ، et al. تحليل التألق المناعي متعدد الإرسال والقياس الكمي للخلايا التائية PD-1 ⁺ Tim-3 ⁺ CD8 ⁺ داخل الورم. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية تصوير متعدد الأطياف الفلورية في الموقع لتحليل مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا التائية المتسللة في أنسجة الورم. يتم علاج تشريح أنسجة سرطان الخلايا الكلوية بالتبريد بالأجسام المضادة لتسمية خلايا CD8 + T التي تعبر عن مستقبلات مثبطة محددة وتظهر نمطا ظاهريا مقاوما للعلاج المناعي. يتم تصور القسم المسمى باستخدام مجهر متعدد الأطياف لتحديد المجموعات السكانية الفرعية المميزة للخلايا التائية CD8 +.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد

< p class = "jove_title" >1. تلطيخ التألق المناعي في الموقع للخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs)

1. المبادئ التوجيهية الإجرائية
   1. قم بتنفيذ جميع الخطوات التجريبية في درجة حرارة الغرفة.
   2. لجميع الخطوات ، قم بإجراء التخفيفات باستخدام Tris Buffer Saline (TBS ؛ انظر جدول المواد).
   3. قم بإجراء الغسيل في TBS لجميع الخطوات باستثناء بعد حضانة الجسم المضاد الأساسي. بالنسبة للأخير ، استخدم Tris Buffer Saline Tween20 (TBST ، انظر جدول المواد). للاطلاع على تكوين المخزن المؤقت وإعادة تشكيله ، انظر الجدول 1.
   4. استخدم غرفة رطوبة لحضانات الأجسام المضادة وجرة تلطيخ للغسيل.
   5. لا تدع القسم يجف أثناء العملية.
2. المعالجه المسبقه
   1. قم بإذابة الشريحة التي تحتوي على عينة المناديل وجفف الشريحة بعناية حول العينة بمنشفة ورقية. حدد منطقة التفاعل التي تحتوي على الأنسجة بقلم حاجز كاره للماء (انظر جدول المواد). يجف لمدة 2 دقيقة.
   2. قم بإصلاح العينات في الأسيتون بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق ، وجففها لمدة دقيقتين ، واغسلها باستخدام TBS لمدة 10 دقائق.
3. التشبع والحصار
   1. عالج الشرائح مسبقا لمدة 10 دقائق باستخدام 3 قطرات من أفيدين 0.1٪ ، اضغط و / أو قم بنقر الشريحة لتوزيع أفيدين وإزالة فقاعات الهواء ، ثم عالجها لمدة 10 دقائق باستخدام 3 قطرات من البيوتين 0.01٪ (انظر جدول المواد) ، انقر و / أو انقر فوق التمرير. يغسل ب TBS.
   2. قم بإجراء حصار لمستقبلات Fc. ضع 100 ميكرولتر من حجم / حجم 5٪ من المصل العادي المخفف في TBS. استخدام المصل من نفس الأنواع المضيفة مثل الجسم المضاد الثانوي أو الثالث المسمى (انظر جدول المواد) ؛ تم استخدام مصل الحمار هنا. احتضان لمدة 30 دقيقة.
   3. أثناء الحضانة ، قم بتدوير الأجسام المضادة المضادة ل CD8 ، وبروتين موت الخلايا المبرمج 1 (PD-1) ، والجلوبولين المناعي للخلايا التائية والأجسام المضادة للبروتين المحتوي على الميوسين -3 (Tim-3) (جدول المواد). تحضير مزيج الأجسام المضادة الأولية في TBS كما هو موضح في الجدول 2.
4. تلطيخ مناعي ل CD8 و PD-1 و Tim-3
   1. تحضير خليط الأجسام المضادة الأساسي. راجع جدول المواد والجدول 2 للأجسام المضادة المستخدمة (anti-CD8 و PD-1 و Tim-3 والأجسام المضادة الثانوية المقابلة لها) وتركيزاتها.
   2. اضغط و/أو قم بتمرير مصل الحمار المتبقي (تمت إضافته في الخطوة 1.3.2). احتضان الشرائح ب 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية غير المسمى لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة.
   3. أثناء الحضانة ، قم بتدوير الأجسام المضادة للأرانب السيانين 5 لفترة وجيزة ، و Alexa Fluor 488-anti-goat ، والأجسام المضادة للفأر البيوتينيل وإعداد مزيج من الأجسام المضادة الثانوية كما هو موضح في الجدول 2.
   4. اغسل الشرائح في TBST لمدة 5 دقائق.
   5. احتضان الشرائح ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة في غرفة مرطبة.
   6. تحضير خليط الأجسام المضادة الثلاثية التي تحتوي على السيانين 3-ستربتافيدين، كما هو موضح في الجدول 2.
   7. اغسل الشرائح في TBS لمدة 10 دقائق.
   8. احتضن الشرائح ب 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الثلاثية لمدة 30 دقيقة.
   9. اغسل الشرائح في TBS لمدة 10 دقائق.
5. تركيب الخلية
   1. قم بتركيب الشرائح في وسط تركيب يحتوي على 4 ',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) (1.5 ميكروغرام / مل DAPI) مع غطاء متوافق مع الفحص المجهري الفلوري (انظر جدول المواد).
      ملاحظه: كعنصر تحكم سلبي لكل تجربة ، تم استخدام شريحة واحدة تحتوي على أجسام مضادة متطابقة مع النمط المتماثل بنفس تركيز الأجسام المضادة المقابلة. لهذا التلوين ، استخدمنا الفأر IgG1 ، والأرانب IgG ، والأجسام المضادة للتحكم السلبية IgG للماعز (انظر جدول المواد). كعنصر تحكم إيجابي ، استخدمنا اللوزتين البشرية المفرطة التنسج ، والتي من المعروف أنها إيجابية للعلامات المختبرة ، لكل تجربة. يتم وصف تلطيخ نموذجي في النتائج (الشكل 1). يجب إجراء التلوين الأحادي ل CD8 و PD-1 و Tim-3 بشكل فردي (تلطيخ واحد لكل شريحة) بنفس المعالجة المسبقة وبدون DAPI. يجب أيضا إجراء شريحة في نفس الظروف التجريبية بدون أي جسم مضاد ووسيط تركيب DAPI فقط. يجب تصوير الشريحة باستخدام ظروف تجريبية متطابقة بدون أي جسم مضاد وبدون DAPI.

< p class = "jove_title" >2. تحليل التألق وعدد الخلايا الآلي

1. الحصول على الصور باستخدام المجهر الآلي
   1. قم بإنشاء بروتوكول.
      1. قم بتشغيل برنامج المجهر الآلي ومصباح الفلورة.
      2. في شريط القائمة ، انقر فوق "ملف" و "إنشاء بروتوكول" وحدد "DAPI" و "FITC" و "TRITC".
      3. انقر فوق "التالي" و "قسم المناديل" وانقر فوق "التالي" و "اسم البروتوكول". اختر اسما ، على سبيل المثال ، "CD8-PD-1-Tim-3" ، وانقر فوق "التالي" و "حفظ".
      4. ضع شريحة يدويا على المسرح.
      5. في شريط القائمة ، انقر فوق "الإعداد" و "الإعدادات". انقر فوق "تعيين الصفحة الرئيسية Z" في النافذة الجديدة.
      6. اضبط وقت التعرض باستخدام شريحة تحكم إيجابية ، أي CD8 و PD-1 و Tim-3 ثلاثية البقع بعينة DAPI.
      7. في شريط التحكم ، انقر فوق "تعيين التعرض".
      8. اضبط وقت التعرض لكل مرشح حتى يتم الحصول على إشارة كافية ولكن غير مشبعة.
      9. للتصوير أحادي اللون، قم بتنفيذ ما يلي:
      10. حدد الاكتساب ، وضمن "التركيز البؤري التلقائي" ، اختر مرشح DAPI.
      11. في "حد منطقة المسح الضوئي"، حرك الجزء العلوي من الهدف إلى الزاوية العلوية اليسرى من الشريحة. انقر فوق "علامة". افعل الشيء نفسه مع الزاوية اليمنى السفلية.
          ملاحظه: تحدد هذه الخطوة منطقة التصوير منخفض الطاقة (تصوير LP) عند 4X. تأكد من وضع العلامة جيدا لإحاطة جميع عينات السلسلة.
      12. للتصوير عالي الطاقة (HP)، قم بإجراء ما يلي:
      13. ضمن "التركيز البؤري التلقائي"، اختر "DAPI".
      14. ضمن نطاق "الاستحواذ"، اختر "DAPI" و"FITC" و"Cy3" و"Cy5". انقر فوق "موافق". انقر فوق "ملف" و "حفظ البروتوكول" في شريط القائمة.
   2. امسح الشرائح.
      1. قم بتحميل البروتوكول بالنقر فوق "ملف" و "تحميل البروتوكول" من شريط القائمة. انقر فوق "ابدأ".
      2. أدخل "معرف المختبر" (موقع المجلد لتخزين الصور). أدخل معرف الشريحة لتحديد الشريحة. انقر فوق "التالي".
      3. انقر فوق "تصوير أحادي اللون" (لمسح الشريحة بأكملها تحت ضوء المجال الساطع والحصول على صور متسلسلة باستخدام هدف 4x).
         ملاحظه: ينتج عن هذا نظرة عامة على التدرج الرمادي للشريحة.
      4. انقر فوق "البحث عن عينة". حدد منطقة الأنسجة المراد مسحها ضوئيا بدقة منخفضة (4x): اضغط مع الاستمرار على مفتاح "Ctrl" وانقر على حقل باستخدام المؤشر لتحديد الحقول أو إلغاء تحديدها (الشكل 2 أ).
      5. انقر فوق "تصوير LP" (تصوير 4x) للحصول على صورة أحمر أزرق وأخضر فلوري لكل حقل.
      6. لتحديد حقل HP ، اضغط باستمرار على مفتاح "Ctrl" وانقر فوق حقل باستخدام المؤشر لتحديد أو إلغاء تحديد الحقول المقابلة لمنطقة الأنسجة التي سيتم مسحها ضوئيا بدقة عالية (20x). حدد 5 حقول (الشكل 2 ب).
      7. انقر فوق "HP Imaging" (تصوير 20x) للحصول على صورة متعددة الأطياف لكل حقل (الشكل 2C).
      8. انقر فوق "تخزين البيانات" لتخزين الصور في المجلد المحدد في البداية في LabID.
         ملاحظه: يتم تلخيص العملية وتوضيحها في الشكل 2. لكل خطوة (اكتشاف الأنسجة ، اختيار الحقل) ، يمكن زيادة خوارزمية وتدريبها من قبل المستخدم لعملية مسح آلي كاملة.

الجدول 1: تكوين المخزن المؤقت ل TBS و TBST. يستخدم TBS لخلطات الأجسام المضادة والتخفيفات. بالنسبة للغسلات ، يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام TBS باستثناء الغسالات التي تتبع الأجسام المضادة الأولية ، حيث يوصى باستخدام TBST.

تبس TBST تريس حمض الهيدروكلوريك 0.05 م 0.05 م كلوريد الصوديوم 0.15 م 0.15 م توين 20 - 0.05٪ الرقم الهيدروجيني 7.6 7.6 اعداد 1 قرص في 500 مل H₂O < p class = "jove_content" >الجدول 2: تكوين مزيج الأجسام المضادة التفصيلي لتلوين التألق المناعي CD8-PD-1-Tim-3. لكل مزيج من الأجسام المضادة الأولية والثانوية والثالثية ، يتم إعطاء التخفيف الذي يجب إجراؤه في الحجم المقابل ل TBS لحجم إجمالي قدره 1 مل. بالنسبة للشريحة الواحدة ، يبلغ إجمالي حجم التفاعل 100 ميكرولتر لمساحة الأنسجة 2 سم².

حجم الجسم المضاد الأولي الخامس النهائي = 1 مل أرنب مضاد ل CD8 ماوس مضاد ل PD-1 الماعز المضادة ل Tim-3 تبس 1.6 ميكرولتر 2 ميكرولتر 30 ميكرولتر 966.4 ميكرولتر حجم الجسم المضاد الثانوي السماوي 5 مكافحة الأرانب مضاد للفأر البيوتينيل أليكسا فلور 488 مضاد للماعز تبس 3.3 ميكرولتر 2 ميكرولتر 2.5 ميكرولتر 992.2 [إ] حجم الجسم المضاد الثلاثي Cy3 المسمى ستربتافيدين تبس 3.3 ميكرولتر 996.7 دولار

النتائج

الشكل 1: تلغيم مناعي CD8-PD-1-Tim-3 على أنسجة مدمجة في البارافين في اللوزتين. تم اختيار أقسام الأنسجة المضمنة في البارافين بدلا من الأقسام المحفوظة بالتبريد للتلوين المناعي الثلاثي. بعد إزالة الشمع وإعادة الترطيب ، تم تطبيق نفس بروتوكول التلوين الذي تم تطويره مسبقا للأقسام المحفوظة بالتبريد. توجد خلايا CD8 + T خارج المركز الجرثومي ، وتتجمع الخلايا التائية غير CD8 + التي تعبر عن PD-1 في المركز الجرثوم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Vectra 3 التصوير الآلي لعلم الأمراض الكمي بيركين إلمر CLS142338 تحليل خلية المعلومات 2.1. بيركين إلمر CLS135781 برنامج R https://www.r-project.org قلم تحديد Dakopen داكو S2002 تريس بافر سالين TBS أقراص تاكارا ، بيو إنك. TAKT9141Z الرقم الهيدروجيني 7.6 100 قرص تريس بافر سالين توين 20 تيرابايت (+ توين 20) تاكارا ، بيو إنك. TAKT9142Z درجة الحموضة 7.6 100 قرص نظام حجب البيوتين داكو إكس 0590 أفيدين 0.1٪ والبيوتين 0.01٪ مصل الحمار العادي جاكسون للأبحاث المناعية 017-000-001 5٪ حجم / حجم تركيز Fluoroshield مع DAPI سيجما ألدريتش F6057 تركيز 1.5 ميكروغرام / مل غطاء زجاجي محبوك Knittel Gläser, 100039 24 × 60 مم 100 زلات غطاء أرنب مضاد ل CD8 استنساخ P17-V نوفوس NBP1-79055 استخدم عند 4 ميكروغرام / مل الماوس المضاد ل PD-1 استنساخ NAT أبكام أب52587 استخدم عند 2 ميكروغرام / مل الماعز المضادة ل Tim-3 البحث والتطوير أيه إف 2365 استخدم عند 3 ميكروغرام / مل أرنب مضاد ل PD-L1 استنساخ SP142 روش 7309457001 استخدم عند 1 ميكروغرام / مل الماوس AF647 المسمى عموم الكيراتين C11 إشارات الخلية 4528 استخدم عند 0.5 ميكروغرام / مل الماعز المضاد للإنسان غال9 البحث والتطوير أيه إف 2045 استخدم عند 0.3 ميكروغرام / مل السماوي 5 الحمار المترافق المضاد للأرانب جاكسون للأبحاث المناعية 711-175-152 استخدم عند 5 ميكروغرام / مل البيوتينيل F (ab'2) حمار مضاد للفأر IgG جاكسون للأبحاث المناعية 715-066-150 استخدم عند 3 ميكروغرام / مل Alexa Fluor488 حمار مترافق مضاد للماعز IgG أبكام أب150133 استخدم عند 5 ميكروغرام / مل Cy3 المسمى ستربتافيدين أميرشام PA43001 استخدم عند 3 ميكروغرام / مل ماوس التحكم السلبي IgG1 داكو X0931 استخدم عند 2 ميكروغرام / مل IgG من مصل الماعز سيجما ألدريتش ط5256 استخدم عند 3 ميكروغرام / مل IgG من مصل الأرانب سيجما ألدريتش I5006 استخدم عند 4 ميكروغرام / مل