مقالة منهجية

تقنية التألق المناعي لتوطين البروتين الفيروسي في الخلايا المصابة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Samrat، S. K. et al. ، التحليل الزمني للانتقال النووي إلى السيتوبلازمي لبروتين فيروس الهربس البسيط 1 بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر المناعي.J. Vis. Exp.(2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة لمراقبة بروتين الخلية المصابة 0 ، ICP0 الاتجار بفيروس الهربس البسيط -1. بعد التوليف من جديد ، ينتقل ICP0 إلى النواة ، ثم ينتقل لاحقا إلى السيتوبلازم أثناء تطور العدوى. يكشف المجهر المناعي عن توطين البروتين تحت الخلوي ويحلل ، ويقدم رؤى حول الاتجار به عبر مراحل العدوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. بذر الخلايا وعدوى الفيروسات

  1. قبل 20-24 ساعة من الإصابة بالفيروس ، سيتم فحص البذور 5 × 104 من خلايا الخلايا الليفية للرئة الجنينية البشرية (HEL) أو خلايا أخرى على شريحة متداخلة من 4 آبار 11 مم في وسط النمو (وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS)). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2).
    ملاحظه: يجب أن يكون لكل بئر 70-80٪ من التقاء الخلايا في وقت الإصابة.
  2. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط النمو وإصابة الخلايا بالفيروسات في Medium-199 في نطاق 4-10 pfu / خلية. احتضان الخلايا المصابة بالفيروس لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. استمر في هز الشريحة خلال فترة الحضانة.
  3. بعد حضانة 1 ساعة ، قم بإزالة Medium-199 واستكماله بوسط النمو.
    ملاحظه: يمكن إضافة الأدوية التي تتداخل مع مراحل العدوى المختلفة في هذه الخطوة أو قبل امتصاص الفيروس.
  4. احتضان الخلايا المصابة بالفيروس عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لفترات مختلفة من فترة الإصابة.
< p class = "jove_title" >2. التثبيت والنفاذية

  1. في وقت الإصابة المناسب ، اغسل الخلايا المصابة بسرعة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 3 مرات وأضف 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد المحضر حديثا في PBS. احتضان الخلايا ببارافورمالدهيد لمدة 8-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا في كل بئر.
  2. شفط بارافورمالدهيد واغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من PBS لمدة 3 مرات. استنشق PBS بالكامل بعد الغسيل 3.
  3. أضف 100 ميكرولتر من 0.2٪ خافض للتوتر السطحي غير أيوني إلى كل بئر لاختراق الخلايا لمدة 5-10 دقائق.
  4. استنشق الفاعل بالسطح غير الأيوني واغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من PBS لمدة 3 مرات.
< p class = "jove_title" >3. تلطيخ الفلورسنت المناعي

    قم
  1. بشفط PBS بالكامل وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 5٪ مصل حصان في PBS) في كل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  2. أضف تركيزا محددا تجريبيا للجسم المضاد الأولي ضد بروتين الخلية المصاب 0 (الأرانب المضاد المضاد ل ICP0 المضاد للجسم المضاد متعدد النسيلة ) في حجب المخزن المؤقت واحتضان الجسم المضاد الأولي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين أو عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  3. يغسل بمحلول مانع 3 مرات مع حضانة لمدة 10 دقائق. أضف الجسم المضاد الثانوي للماعز المترافق Alexa 594 (1: 400 مخفف في المخزن المؤقت الحظر) واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. ثم اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام مخزن مؤقت مانع كل 10 دقائق.
  4. أخيرا ، اغسل الشريحة مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة BSA ومصل الحصان المتبقي.
  5. أضف قطرة واحدة من وسط التثبيت المضاد للبهتان مع 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لتركيب الشريحة وإغلاقها بغطاء باستخدام طلاء أظافر شفاف.
< p class = "jove_title" >4. التصوير متحد البؤر

  1. باستخدام المجهر متحد البؤر ، اضبط الطول الموجي على 590-650 نانومتر ل Alexa 594 و 410-520 نانومتر ل DAPI. حدد تنسيق الصورة بدقة 1024 × 1024 ومتوسط الخط 8 للحصول على صور عالية الدقة.
  2. قم بتحليل كل بئر على شريحة 4 آبار تحت مجهر متحد البؤر. الحصول على صور خلية تمثيلية تحت هدف 100X ، كما هو موضح في الشكل 1 والشكل 2.
  3. لحساب أعداد كبيرة من الخلايا ، التقط صورا للحقول المتتالية ضمن الهدف 40X.
    ملاحظه: يتطلب الأمر من 5 إلى 10 صور لتجميع أكثر من 200 خلية مصابة من كل نقطة زمنية لكل عدوى.
  4. في كل تجربة ، التقط صورا بمعلمات متحد البؤر ثابتة لجميع العينات التي تحتاج إلى مقارنة.
فئة

5. تحليل التوزيع النووي مقابل السيتوبلازمي

  1. افتح المشروع باستخدام برنامج التطبيق متحد البؤر. حدد صورة تحتاج الخلايا منها إلى الجدولة للتوزيع النووي مقابل السيتوبلازمي ل ICP0.
  2. انقر فوق علامة التبويب "الكمية" من القائمة العلوية وحدد "فرز عائد الاستثمار" من قائمة الأدوات.
  3. ارسم خطا طوليا عبر الخلية المراد تحليلها عن طريق تحديد "رسم خط" من القائمة العلوية. < / > ملاحظه: سيظهر الرسم البياني الذي يوضح شدة التألق على طول الخط لكل من ICP0 و DAPI. في الرسم البياني ، يمثل الخط الأزرق وحدات بكسل DAPI ويشير إلى حدود النواة بينما يمثل الخط الأحمر ICP0 بكسل.
  4. بناء على تلطيخ الخلفية ، قم بإعداد عتبة ثابتة لكثافة ICP0 لتحليل التوزيع الخلوي ICP0 في كل تجربة.
    1. كما هو موضح في الشكل 2 ، إذا كانت الإشارة الحمراء في المتوسط أقل من العتبة في المنطقة النووية ولكنها أعلى من العتبة خارج الحدود الزرقاء ، فقم بتصنيف الإشارة الحمراء على أنها تقع في الغالب في السيتوبلازم.
    2. إذا كانت الإشارة الحمراء أعلى من العتبة في جميع أنحاء النواة وخارج حدود الإشارة الزرقاء ، فقم بتجميع الإشارة الحمراء كنواة بالإضافة إلى التوطين السيتوبلازمي.
    3. إذا كانت الإشارة الحمراء أعلى من العتبة في النواة ولكن في المتوسط كانت أقل منها خارج حدود الإشارة الزرقاء ، فقم بتجميع الإشارة الحمراء على أنها توطين نووي.
  5. قم بجدولة أكثر من 200 خلية مصابة من كل عينة في وقت إصابة مختلف وارسم في الرسم البياني الشريطي لتوضيح حركة ICP0 وفقا للوقت (الشكل 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: الاتجار الديناميكي ب ICP0 أثناء الإصابة بفيروس الهربس البسيط -1.أصيبت خلايا HEL المزروعة على شرائح ذات 4 آبار بالنموذج الأولي ل HSV-1 (السلالة F) عند 10 pfu / خلية. في 1 و 5 و 9 ساعات بعد الإصابة (hpi) ، تم إصلاح الخلايا ، ونفاذها ، وتفاعلها مع الأرانب المضادة ل ICP0 والأجسام المضادة الأولية للفأر المضادة ل PML ، ثم تفاعلت مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب Alexa 594 و Al...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الخلايا والفيروسات الخلايا الليفية الرئوية الجنينية البشرية (خلايا HEL) الدكتور توماس إي شينك (جامعة برينستون) نمت خلايا HEL في DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS مخزون فيروس HSV-1 (السلالة F) مختبر الدكتور برنارد رويزمان متوسط وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) إنفيتروجين 11965-092 مصل الأبقار الجنينية (FBS) سيغما F0926-500 مل متوسط 199 (10X) جيبكو 11825-015 الكواشف 4- شريحة متداخلة بئر 11 مم سيل لاين / ثيرموفيشر العلمي 30-149H-أسود 16٪ محلول بارافورمالدهايد (وزن / حجم) خالي من الميثانول الترمو: العلمية هاتف 28908 تريتون X-100 كواشف فيشر بي ت 151-1C0 مصل الأبقار أبومين (BSA) كالبيوكيم سجل المستخلصات الكيميائية 9048-46-8 مصل الحصان سيغما H1270 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي Na2HPO4 ، درجة الحموضة 7.4) مختبر الدكتور هايدونغ جو كلوريد الصوديوم كاشف فيشر الحيوي ص358-212 كيه 2 ب 4 كاشف فيشر الحيوي BP362-500 كيه سي إل فيشر ساينتيك BP366-500 Na2HPO4 كاشف فيشر الحيوي BP332-500 المخزن المؤقت المانع (PBS مع 1٪ BSA و 5٪ مصل الحصان) مختبر الدكتور هايدونغ جو ربيعت الأجسام المضادة ل ICP0 مختبر الدكتور هايدونغ جو PML (PG-M3) - IgG أحادي النسيلة للفأر سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية SC-966 Alexa Fluor 594-ماعز مضاد للأرانب IgG إنفيتروجين أ 11012 Alexa Fluor 488-ماعز مضاد للفأر IgG إنفيتروجين أ 11001 وسيط Vectashield Mouting مع DAPI مختبرات النواقل إتش-1200 ماصة باستور فيشر براند 13-678-20 د طلاء الأظافر سالي هانسن معدات مجهر متحد البؤر لايكا SP8 برنامج متحد البؤر مجموعة تطبيقات Leica LAS X برنامج Excel مايكروسوفت إكسل حاضنة HERAcell 150i CO2 الترمو: العلمية رمز الطلب 51026282

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

1 ICP0 DAPI

مقالات ذات صلة