طريقة في المختبر لتحديد الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية الموجودة في رئتي الفئران

الملخص

المصدر: Christofides، A.، et al. تحليل قياس التدفق الخلوي لتحديد الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية لرئة الفئران.

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لتحديد الخلايا المناعية الموجودة في رئتي الفئران. بعد عزل الخلايا المناعية المستهدفة من أنسجة رئة الفئران ، يتم تصنيفها على السطح باستخدام مزيج من الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور ضد علامات محددة على الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصنيف الخلايا الوحيدة والضامة والخلايا المتغصنة باستخدام علامة داخل الخلايا. ثم يتم تحديد أنواع الخلايا المناعية المختلفة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. الاستئصال الجراحي وإعداد الأنسجة

1. القتل الرحيم للفأر عن طريق حقن 1 مل من ثلاثي بروموإيثانول داخل الصفاق (أعد وفقا للبروتوكول القياسي; جدول المواد).
   ملاحظه: يجب تجنب اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ في دراسات الرئة لأنه قد يسبب إصابة في الرئة ويغير ميزات وخصائص الخلايا المناعية للرئة. يجب أيضا تجنب خلع عنق الرحم لأنه قد يتسبب في إصابة ميكانيكية في الرئة.
2. انقل الماوس إلى منطقة نظيفة ومخصصة للعملية الجراحية.
3. قم بتثبيت الجانب الظهري للفأر لأسفل باستخدام الإبر أو الشريط اللاصق على الأطراف الأربعة. استخدم 70٪ إيثانول لتعقيم بشرة المنطقة البطنية.
4. قم بإجراء شق في الجلد ، من الرقبة إلى البطن. قم بإزالة الجلد بعناية من منطقة الصدر.
5. قم بإزالة القص والأضلاع بعناية.
6. اغسل الرئتين عن طريق حقن 10 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات البارد (PBS) مباشرة في البطين الأيمن ، باستخدام إبرة 18-21 جم ، حتى تصبح الرئتان بيضاء تماما.
7. قم بإزالة الغدة الصعترية والقلب بعناية دون لمس الرئتين.
8. افصل الرئتين برفق عن الأنسجة المحيطة وانقلهما إلى أنبوب به عازلة ألبومين مصل البقر البارد (BSA) (الجدول 1).
   ملاحظه: يجب بذل جهد لإزالة جميع الدهون المجاورة من الرئتين قبل زيادة تحضير المعلق أحادي الخلية ، لأن هذا قد يؤدي إلى تحيز القراءات.

فئة

2. تحضير تعليق خلية واحدة

1. انقل الرئتين إلى طبق بتري فارغ وافرمهما بمشرطين ناعمين. انقل جميع قطع الرئة المفرومة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. استخدم 5 مل من محلول الهضم لغسل الطبق وإضافته إلى أنبوب 50 مل يحتوي على الرئة المفرومة (الجدول 1).
   ملاحظه: يجب تحضير عازلة الهضم مباشرة قبل الاستخدام. استخدم 5 ملغم/مل من الكولاجيناز. لم يؤد الجمع بين 1 أو 5 ملغ من الكولاجيناز مع المخزن المؤقت BSA أو PBS الخالي من البروتين إلى تحسين النتائج (الشكل 1).
2. قم بتأمين غطاء الأنبوب وهضم الرئة لمدة 30 دقيقة على شاكر مداري بسرعة 150 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. أوقف التفاعل بإضافة 10 مل من المخزن المؤقت BSA البارد.
3. بعد الهضم ، استخدم إبرة 18 جم لخلط وإذابة قطع الرئة. ضع مصفاة مرشح 70 ميكرومتر في الجزء العلوي من أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
   ملاحظه: قد يؤدي استخدام مرشح ميكرون أصغر إلى فقدان التجمعات النخاعية الرئيسية.
4. انقل خليط الرئة المهضوم ببطء مباشرة على المصفاة. استخدم الجانب المطاطي لمكبس حقنة سعة 10 مل لتحطيم قطع الرئة المتبقية على الفلتر. اغسل المواد المعالجة على الفلتر باستخدام المخزن المؤقت BSA.
5. جهاز الطرد المركزي لنظام التعليق أحادي الخلية عند 350 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. تخلص من المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول تحلل الأمونيوم - كلوريد - البوتاسيوم (ACK). تخلط جيدا باستخدام ماصة سعة 1 مل ، وتحتضن لمدة 90 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
7. أضف 10 مل من المخزن المؤقت BSA البارد لإيقاف التفاعل وجهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص بعناية من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في Staining Buffer لحساب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
8. أعد تعليق الخلايا بتركيز 5 × 10⁶ خلايا / مل واستخدمها لتلوين السطح (انظر القسم 2).
   ملاحظه: لهذا الغرض ، قم بوضع الخلايا في صفيحة دائرية القاع ذات 96 بئرا متبوعة بتلوين الأجسام المضادة وغسلها. إذا لم يكن جهاز الطرد المركزي للوحة متوفرا ، فاستخدم أنابيب التدفق بدلا من الألواح. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن الحصول على ~ 15-20 × 10⁶ خلايا لكل رئة من فأر C57BL / 6 يبلغ من العمر 6-10 أسابيع بمتوسط الحجم.

< p class = "jove_title" >3. تلطيخ الأجسام المضادة السطحية

1. انقل 1 × 10⁶ خلايا في 200 ميكرولتر لكل بئر في طبق 96 بئر. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 350 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول كتلة Fc عن طريق تخفيف الجسم المضاد المضاد ل 16/32 (1: 100) في مخزن التلوين (الجدول 1).
2. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من محلول حجب FC المحضر مسبقا (جدول المواد) واحتضانه لمدة 15-20 دقيقة عند 4 درجات مئوية أو على الجليد.
3. أضف 150 ميكرولتر من محلول التلوين وقم بالطرد المركزي للوحة عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة السطحية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة السطحية (1: 100 ؛ الجدول 2) في تلطيخ العازلة.
   ملاحظة: (ط) يمكن استخدام الجسم المضاد المضاد 16/32 لحجب FC مع الأجسام المضادة السطحية في نفس الخليط. (ii) إذا تم استخدام صبغة قابلة للصلاحية قابلة للإصلاح ، فقم بإضافتها إلى كوكتيل الأجسام المضادة السطحية عند تخفيف قدره 1: 1,000.
4. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية المحضرة مسبقا واحتضانها لمدة 30-40 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام. اغسل الخلايا بمخزن مؤقت للتلطيخ مرتين.
   ملاحظه: إذا لم تكن هناك حاجة إلى تلطيخ داخل الخلايا ، فقم بتعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين وانتقل مباشرة إلى الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي. بدلا من ذلك ، قد يتم إصلاح الخلايا وتخزينها عند 4 درجات مئوية للحصول عليها لاحقا. نوصي باستخدام الخلايا لقياس التدفق الخلوي في غضون 24 ساعة.

< p class = "jove_title" >4. تثبيت الخلايا والتلوين داخل الخلايا

1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتثبيت / النفاذية (Fix / Perm Buffer) عن طريق خلط ثلاثة أجزاء من تركيز التثبيت / النفاذية وجزء واحد من مخفف التثبيت / النفاذية لمجموعة FoxP3 / Transcription Factor Staining Buffer (الجدول 1).
2. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من Fix / Perm Buffer المحضر مسبقا لكل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا ، حيث تم طلاء الخلايا كما هو موضح في القسم 3 ، واحتضانها لمدة 20-25 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
3. قم بتخفيف المخزن المؤقت للنفاذية 10x ك 1: 10 في الماء النقي منزوع الأيونات لإعداد 1x buffer للنفاذية.
4. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x النفاذية المؤقتة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا عن طريق تخفيف الأجسام المضادة داخل الخلايا (1: 100) في 1 مل من المخزن المؤقت للنفاذية.
5. أعد تعليق الخلايا باستخدام 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية المحضرة مسبقا لكل خلية من اللوحة المكونة من 96 بئرا واحتضانها لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
6. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام عازلة النفاذية ومرة واحدة باستخدام محلول تلطيخ. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.
   ملاحظه: إذا لم يتوفر مقياس التدفق الخلوي مع قارئ اللوحة ، فقم بنقل الخلايا إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي.
7. احصل على ما لا يقل عن 1.5 × 10⁶ خلايا لكل عينة على مقياس التدفق الخلوي.
   ملاحظه: بالنسبة للألوان المفردة وعينات التحكم غير الملوثة ، ستكون 0.5-1 × 10⁶ خلايا لكل عينة كافية. يوصى بمعايرة الأجسام المضادة الفردية المستخدمة لتحقيق التلوين الأمثل وتقليل التكاليف. تم تحسين البروتوكول الحالي باستخدام Fix / Perm Buffer الذي تم إعداده باستخدام مجموعة المخزن المؤقت FoxP3. نظرا لأن CD68 عبارة عن علامة سيتوبلازمية وليست علامة نووية ، فقد تكون حلول النفاذية الأخرى مثل التركيز المنخفض من بارافورمالديهايد أو مجموعات التثبيت الخلوي / العصارة الخلوية من بائعين مختلفين كافية.

الجدول 1: المخازن المؤقتة.

المخزن المؤقت BSA PBS + 0.5٪ ألبومين مصل بقري عازلة الهضم مخزن BSA مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) + 5 مجم / مل كولاجيناز من النوع 1 + 0.2 مجم / مل DNase I تلطيخ المخزن المؤقت PBS + 2.5٪ FBS الإصلاح / بيرم المخزن المؤقت ثلاثة أجزاء من مخفف التثبيت / النفاذية و 1 جزء من مخفف التثبيت / النفاذية لمجموعة Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer المخزن المؤقت للنفاذية 10x المخزن المؤقت للنفاذية من Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer المخفف 10 مرات في الماء المنقى منزوع الأيونات

الجدول 2: استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.

مستضد استنساخ فلوروكروم التخفيف السطح / داخل الخلايا سي دي 45 30-F11 APC / CY7 1:100 سطح غرام 1 RB6-8C5 هب ف421 1:100 سطح CD68 FA-11 بالنسبة للتكلفة النفكية5.5 1:100 داخل الخلايا CD11b م 1 / 70 PECy7 1:100 سطح سيجليك إف S17007L فيتك 1:100 سطح CD11c رقم 418 BV650 أو BV510 1:100 سطح CD64 X54-5 / 7.1 PE / انبهار 594 1:100 سطح معقد التوافق النسيجي الثاني م 5 / 114.15.2 AF700 1:100 سطح سي دي 103 2.00 إ +07 PE / FITC 1:100 سطح طقم وصمة عار الخلية الميتة للقراءة البعيدة / الميتة قابلة للإصلاح FarRed (APC) أو Aqua (BV510) 1:1000 سطح CD3 17 أ 2 PE 1:100 سطح ب 220 RA3-6B2 أيه إف 488 1:100 سطح NK1.1 PK136 فيتك 1:100 سطح سي دي 24 30-F1 PE 1:100 سطح ميرتك 2ب 10 ج 42 PE 1:100 سطح F4 / 80 ب م 8 BV605 1:100 سطح سي اكس 3 سي آر 1 SA011F11 PE 1:100 سطح إف سي بلوك (CD16 / 32) 93 1:100 سطح

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: يتم تحقيق أفضل تفكك خلوي عن طريق 5 مجم / مل من الكولاجيناز 1 في PBS الدافئ مسبقا + 0.5٪ BSA. في جميع الظروف المختلفة ، تم أيضا تضمين 0.2 مجم من الحمض النووي. الاختصارات: BSA = ألبومين مصل الأبقار. FSC-A = منطقة ذروة الضوء المتناثر إلى الأمام ؛ L / D = تلطيخ حي / ميت ؛ SF = Siglec F.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 10 مل مكبس حقنة إكسيلينت هاتف: 26265 18 جرام إبر إبرة الانزلاق الدقة BD 305165 21 جرام إبر إبرة الانزلاق الدقة BD 305195 50 مل أنابيب مخروطية صقر 3520 مصفاة خلية 70 ميكرومتر ثيرموفيشر 22363548 96 أطباق بئر فالكون / كورنينج 3799 ACK Lysing Buffer ثيرموفيشر أ10492-01 مضاد للفأر CD11b بيوليجند 101215 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 مضاد للفأر CD11c بيوليجند 117339 / 117337 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 مضاد للفأر CD45 بيوليجند 103115 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 مضاد للفأر CD64 بيوليجند 139319 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 مضاد للفأر CD68 بيوليجند 137009 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 مضاد للفأر GR-1 بيوليجند 108433 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 مكافحة الماوس Siglec F بيوليجند 155503 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 أفرتين سيجما ألدريتش 240486 ب 220 بيوليجند 103228 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش 9048-46-8 سي دي 103 بيوليجند 121405 / 121419 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 سي دي 24 بيوليجند 138503 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 CD3 بيوليجند 100205 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 الطرد المركزي الكولاجيناز النوع 1 شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية LS004196 سي اكس 3 سي آر 1 بيوليجند 149005 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 DNase I ميليبور سيجما 10104159001 ايثانول F4 / 80 بيوليجند 123133 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 إف سي بلوك (CD16 / 32) بيوليجند 101301 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 مصل الأبقار الجنينية أنظمة البحث والتطوير ملقط مسنن ناعم شركة روبوز للأدوات الجراحية Foxp3 / مجموعة العازلة لتلطيخ عامل النسخ ثيرموفيشر 00-5523-00 مشرط السلامة Futura أنظمة الاستحقاق الطبية رسالة نصية210 طقم وصمة عار الخلية الميتة للقراءة البعيدة / الميتة قابلة للإصلاح ثيرموفيشر L34973 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 ميرتك بيوليجند 151505 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 معقد التوافق النسيجي الثاني بيوليجند 107621 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 NK1.1 بيوليجند 108705 للاطلاع على التفاصيل، انظر الجدول 2 شاكر مداري VWR نموذج 200 طبق بتري صقر 351029 جهاز طرد مركزي مبرد على الطاولة سورفال سانت 16 آر مقص منحني صغير شركة روبوز للأدوات الجراحية