قياس كفاءة البلعمة في البلاعم باستخدام العلاج الديناميكي والضوئي

الملخص

< p class = "jove_content" >

يوضح الفيديو تقييم تأثير العلاج الضوئي الديناميكي على كفاءة البلعمة في البلاعم الفئران باستخدام بريماكين. تولد البلاعم المعالجة والمصابة أنواعا من الأكسجين التفاعلية ، مما يؤدي إلى موت فطري انتقائي ، يتضح من خلال تقليل المستعمرات على اللوحة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير خلايا المستخفيات

قم
1. بإخراج كائن اختبار كائن الحي بحلقة تلقيح على صفيحة أجار معقمة من مستخلص الخميرة والشعير (YM).
2. احتضان لوحة أجار عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
3. استخدم حلقة التلقيح لغرف 5 مستعمرات مفردة وتعليقها في 5 مل من الماء المقطر المعقم.
4. قم بتوحيد الخلايا باستخدام معيار McFarland للحصول على تركيز خلية يتراوح بين 0.5 × 10⁵ و 2.5 × 10⁵ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) لكل مل من وسط RPMI-1640.
5. قم بتوزيع معلق خلية سعة 100 ميكرولتر في آبار من ألواح الميكروتيتر التي تحتوي على الضامة المصنفة (انظر القسم أدناه).

< p class = "jove_title" >2. تحضير البلاعم

1. قم بزراعة خط خلايا بلاعم الفئران ، RAW 264.7 ، على قارورة أنسجة تحتوي على 10 مل من وسط RPMI-1640 ، مكملة ب 20 مجم / مل من الستربتومايسين ، و 2 ملي لجلوتامين ، و 20 وحدة / مل من البنسلين ، و 10٪ مصل بقري للجنين.
2. ضع القارورة في حاضنة_CO2 بنسبة 5٪ مثبتة عند 37 درجة مئوية حتى يتم تحقيق التقاء 80٪.
3. اكشط الخلايا برفق باستخدام مكشطة الخلية.
4. انقل الخلايا العالقة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
5. استخدم بقعة التريبان الزرقاء لتحديد صلاحية الخلية.
   ملاحظه: يفضل الحصول على درجة الجدوى التي تزيد عن 85٪.
6. استخدم مقياس كثافة الدم لضبط تركيز خلية الضامة إلى 1 × 10⁶ خلايا / مل باستخدام محلول 10 مل من وسط RPMI-1640 الطازج والمعقم.
7. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من المعلق من الخلايا في آبار صفيحة ميكروتيتر معقمة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا.
8. احتضن اللوحة طوال الليل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية
   ملاحظه: قبل الاستخدام ، يجب شفط الوسائط المستهلكة بين عشية وضحاها واستبدالها ب 100 ميكرولتر من وسائط Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) الطازجة والمعقمة.

< p class = "jove_title" >3. تحضير المركب

1. قم بإذابة محسسات الاختبار الضوئية و primaquine (PQ) في الماء المقطر لتحضير محلول المخزون.
2. قم بتخفيف المركب بشكل أكبر في وسائط RPMI-1640.
   ملاحظه: يجب ألا تتجاوز الكمية النهائية من الماء المقطر في وسائط RPMI-1640 1٪.
3. قم بتوزيع محلول 100 ميكرولتر من المحسس الضوئي المحضر لمضاعفة التركيز المطلوب أربع مرات في الآبار المناسبة التي تحتوي على البلاعم المصنفة بالفعل وخلايا المكورات المشفرة.

< p class = "jove_title" >4. تنفيذ المعالجة الضوئية الديناميكية (PDT)

1. قم بإعداد الشروط التجريبية التالية:
   1. الخلايا المستزرعة المشتركة مع 0 ميكرومتر من PQ وتتعرض للضوء الداكن (DL) لمدة دقيقتين (أي الخلايا غير المعالجة (غير Rx))
   2. الخلايا المستزرعة المشتركة مع 6 ميكرومتر وتعرضت ل DL لمدة دقيقتين (أي تأثير الدواء)
   3. الخلايا المستزرعة المشتركة 15 ميكرومتر من PQ وتعرضت ل DL لمدة دقيقتين (أي تأثير الدواء)
   4. الخلايا المستزرعة بشكل مشترك مع 30 ميكرومتر من PQ وتعرضت ل DL لمدة دقيقتين (أي تأثير الدواء)
   5. خلايا مستزرعة مشتركة مع 0 ميكرومتر من PQ وتعرضت للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة دقيقتين (تأثير الأشعة فوق البنفسجية)
   6. خلايا مستزرعة مشتركة مع 6 ميكرومتر من PQ وتعرضت للأشعة فوق البنفسجية (UVL) لمدة دقيقتين (أي تأثير PDT)
   7. خلايا مستزرعة مشتركة مع 15 ميكرومتر من PQ وتعرضت للأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين (أي تأثير PDT)
   8. الخلايا المستزرعة بشكل مشترك مع 30 ميكرومتر من PQ وتعرضت للأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين (أي تأثير PDT)
      ملاحظه: يجب السماح للخلايا المستزرعة المشتركة بالتفاعل مع PQ لمدة 30 دقيقة في الظلام (عند الاقتضاء) ، قبل التعرض للأشعة فوق البنفسجية (عند الاقتضاء).
      ملاحظه: في العمل الحالي ، قررنا أن PQ لديه امتصاص للأشعة فوق البنفسجية / Vis يبلغ 260 نانومتر ، وهو في نطاق الأشعة فوق البنفسجية للمصباح المبيد للجراثيم. بسبب هذا الأخير ، استخدمنا مصباح الأشعة فوق البنفسجية C (UVC) المبيد للجراثيم المثبت في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية كمصدر للضوء لتنفيذ PDT. يقال إن المصباح لديه طاقة اسمية تبلغ 30 واط. تم الاحتفاظ بالخلايا على بعد حوالي 20 سم من المصباح في الدراسة الحالية. عند هذه المسافة ، يقدر أن ناتج إشعاع المصباح يبلغ 625 ميكروواط / سم².

< p class = "jove_title" >5. عد المستعمرات لتحديد بقاء خلايا المكورات المشفرة

1. بعد بدء المعالجة الضوئية الديناميكية للخلايا المزروعة المشتركة كما هو موضح أعلاه ، احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 18 ساعة.
2. بعد 18 ساعة ، استنشق المادة الطافية.
3. اغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من محلول الفوسفات العازل (PBS) لغسل الخلايا غير الداخلية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
4. أضف 300 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X-100 إلى الآبار واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
5. استنشق محتويات الآبار وقم بتوزيعها في أنابيب بلاستيكية معقمة سعة 1.5 مل.
6. تحضير 1 في 10 تخفيف للخلايا بالماء المقطر.
   ملاحظه: اضبط التخفيف بحيث يمكن استرداد ما بين 30 و 300 مستعمرة على ألواح أجار.
7. الماصة 50 ميكرولتر من التخفيف على صفيحة أجار خميرة الشعير (YM).
8. استخدم طريقة لوحة الانتشار لإنشاء عشب التقاء للخلايا على سطح لوحة الأجار.
9. احتضان الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
10. عد وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) التي تم تطويرها على ألواح الأجار.

المواد