تأثير الأسبرين والإيبوبروفين على قدرة البلعمة للبلاعم

الملخص

< p class = "jove_content" >

يعرض هذا الفيديو طريقة لتقييم تأثير الأسبرين والإيبوبروفين ، عند الحد الأدنى من تركيزاتهما المثبطة ، على البلعمة البلاعمية باستخدام الخلايا الفطرية الملطخة بالصبغة الفلورية الحساسة للأس الهيدروجيني. تمنع الأدوية الأكسدة الحلقية -2 ، مما يقلل من تكوين البروستاجلاندين ويعزز البلعمة الضامة ، كما لوحظ من خلال قياسات التألق للصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. اعتبارات السلامة

1. يجب على الموظفين استخدام معدات الحماية الشخصية (PPE).
2. تعامل مع مسببات الأمراض والضامة في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.

< p class = "jove_title" >2. تحضير البلاعم

1. قم بزراعة خط خلايا بلاعم الفئران ، RAW 264.7 ، في قارورة أنسجة تحتوي على 10 مل من وسط معهد روزويل بارك التذكاري -1640 (RPMI-1640) ، مكمل ب 20 مجم / مل من الستربتومايسين ، و 2 ملي لتر جلوتامين ، و 20 وحدة / مل بنسلين و 10٪ مصل بقري جنين (FBS).
2. ضع القارورة في حاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون (CO₂) مثبتة على درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يتم تحقيق التقاء بنسبة 80٪.
3. اكشط الخلايا برفق باستخدام مكشطة الخلية.
4. انقل الخلايا العالقة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
5. استخدم بقعة التريبان الزرقاء لتحديد صلاحية الخلية.
   ملاحظه: يفضل الحصول على درجة الجدوى التي تزيد عن 85٪.
   استخدم مقياس كثافة الدم لضبط تركيز خلية الضامة إلى 1 × 10⁵ خلايا / مل باستخدام محلول 10 مل من وسط RPMI-1640 الطازج والمعقم. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا في آبار من لوحة ميكروتيتر معقمة ذات قاع مسطح 96 بئرا. احتضان اللوحة طوال الليل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5}٪ عند 37 درجة مئوية
   ملاحظه: يجب شفط الوسائط المستهلكة بين عشية وضحاها واستبدالها ب 100 ميكرولتر من وسائط RPMI-1640 الطازجة والمعقمة قبل الاستخدام.

فئة

3. تحضير خلايا المكورات

المشفرة

قم
1. بإخراج كائن اختبار كائن الحي بحلقة تلقيح على صفيحة أجار معقمة من مستخلص الخميرة والشعير (YM).
2. احتضان لوحة أجار عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
3. باستخدام حلقة التلقيح ، قم بتلقيح حلقة من الخلايا في 100 مل من مرق قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB) المكمل بنسبة 4٪ جلوكوز.
4. قم بتنمية الخلايا (ما قبل الزراعة) طوال الليل أثناء الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية.
5. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 0.1 مل من ما قبل الزراعة في مرق YNB الطازج (الثقافة الرئيسية) واسمح للخلايا بالنمو حتى منتصف المرحلة الأسية (في نفس ظروف الزراعة).
6. اغسل الخلايا مرتين بمحلول عازلة الفوسفات (PBS).
7. باستخدام مقياس كثافة الدم ، قم بتوحيد الخلايا إلى 1 × 10⁵ في PBS.

< p class = "jove_title" >4. تلطيخ خلايا المكورات المشفرة بصبغة البلعمة

1. قم بتوزيع 999 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل.
2. أضف 1 ميكرولتر من صبغة الزيموزان الخضراء phrodo إلى نفس الأنبوب.
3. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، في الظلام ، مع تحريض بطيء للتفاعل مع البقعة.
4. في نهاية فترة الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.
5. قم بتوزيع معلق خلية 100 ميكرولتر على الآبار التي تحتوي على البلاعم المصنفة.

< ص الفئة = "jove_title" >5. تحضير الأدوية

1. تحضير محلول الأسبرين باستخدام 1 مجم من الأسبرين في 1000 مل من الإيثانول المطلق إلى تركيز نهائي يبلغ 1000 ميكروغرام / مل.
2. قم بتخفيف المركب بشكل أكبر في وسائط RPMI-1640 للوصول إلى تركيزات الدواء المطلوبة.
   ملاحظه: يجب ألا تتجاوز الكمية النهائية من الإيثانول في وسائط RPMI-1640 1٪. تحضير محلول مخزون من الإيبوبروفين باستخدام 1 ملغ من الإيبوبروفين في 1000 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). قم بتخفيف المركب بشكل أكبر في وسائط RPMI-1640 للوصول إلى تركيزات الدواء المطلوبة.
   ملاحظه: يجب ألا يتجاوز المبلغ النهائي من DMSO في وسائط RPMI-1640 1٪. قم بإعداد محلول 100 ميكرولتر من الأدوية المحضرة بأربعة أضعاف التركيزات المطلوبة وقم بتوزيعها في الآبار المناسبة التي تحتوي على البلاعم المصنفة وخلايا المستخفيات.

< p class = "jove_title" >6. تأثير العوامل الحساسة للعلاج الكيميائي على البلعمة الضامة

1. احتضان الصفائح بخلايا مستزرعة مشتركة في وجود عوامل حساسة للعلاج الكيميائي أو الأسبرين أو الإيبوبروفين في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5٪ عند} 37 درجة مئوية لمدة ساعتين أو 6 ساعات.
2. في نهاية فترة الحضانة ، قم بقياس التألق المستحث (على سبيل المثال: 492 نانومتر و em: 538 نانومتر).
   ملاحظه: تتألق صبغة الفرودو فقط في البيئات الحمضية ، مثل داخل البلعمة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات اجار ميرك تستخدم لتحضير لوحات YM مستخلص الخميرة ميرك تستخدم لتحضير لوحات YM مستخلص الشعير ميرك تستخدم لتحضير لوحات YM الببتون ميرك تستخدم لتحضير لوحات YM قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB) مختبرات ديفكو تستخدم في زراعة خلايا المكورات المشفرة الجلوكوز ميرك تستخدم لتحضير لوحات YM صبغة تريبان الزرقاء سيجما ألدريتش تعداد الخلايا الحية والميتة محلول عازلة الفوسفات (PBS) سيجما ألدريتش غسل وتخفيف الخلايا RPMI- 1640 متوسط بيوكروم وسائط زراعة البلاعم مصل الأبقار الجنينية (FBS) بيوكروم تستخدم لتكملة وسيط RPMI-1640 البنسلين / الستربتومايسين / إل جلوتامين سيجما ألدريتش تمت إضافته إلى وسيط RPMI-1640 phrodo زيموسان الأخضر وصمة عار تقنيات الحياة تستخدم لتلطيخ الخلايا الداخلية بسبب تغير في درجة الحموضة حمض أسيتيل الساليسيليك (الأسبرين) سيجما ألدريتش الدواء المراد اختباره الإيثانول المطلق ميرك يستخدم لإذابة الأسبرين الايبوبروفين سيجما ألدريتش الدواء المراد اختباره ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ميرك يستخدم لإذابة الإيبوبروفين ألواح ميكروتيتر مسطحة القاع ذات 96 بئر غرينر بيو ون تستخدم كوعاء يتم فيه تنفيذ التفاعلات قارورة الأنسجة لاسيك تستخدم لزراعة البلاعم أنبوب الطرد المركزي 15 مل لاسيك تستخدم لاحتواء البلاعم مكشطة الخلية لاسيك تستخدم لفصل البلاعم عن قارورة الأنسجة حلقة التلقيح لاسيك تستخدم لرسم الثقافة على لوحة أجار مقياس الدم مارينفيلد لتحديد تركيز خلية البلاعم 1.5 مل أنابيب بلاستيكية ميرك تستخدم كوعاء يتم فيه تنفيذ التفاعلات EZ Read 800 مقياس الطيف الضوئي البحثي بيوكروم لقراءة الكثافة البصرية فلوروسكان الصعود FL حراري علمي لقياس التألق حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ ثيرمو فيشر تستخدم لاحتضان البلاعم خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية إسكو للعمل بأمان مع مسببات الأمراض دون التسبب في ضرر للمستخدم.