طريقة التألق المناعي لقياس تحييد الفيروس المضخم للخلايا البشري

الملخص

< p class = "jove_content" >

يوضح هذا الفيديو مقايسة التألق المناعي المصممة لقياس تحييد الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV). يتم خلط الأجسام المضادة الخاصة بالفيروس مع الفيروس وتحضنها بخلايا الخلايا الليفية البشرية. تعمل الأجسام المضادة على تحييد الفيروس ، مما يجعله غير قادر على إصابة الخلايا المضيفة ، بينما تصيب الفيروسات غير المعادلة الخلايا. بعد الحضانة ، يتم تحديد مدى التحييد عن طريق تحديد الخلايا المصابة بالفيروس باستخدام التألق المناعي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلايا المستهدفة للعدوى

1. الخلايا المستهدفة للبذور في اليوم السابق لإجراء التجربة في صفيحة مكونة من 96 بئرا (صفيحة "الهدف").
2. قم بلوحة خلايا كافية لكل بئر لضمان طبقة أحادية الطبقة تقريبا (~ 90٪.
   ملاحظه: سيعتمد هذا على الحجم النسبي لنوع الخلية المستهدفة. في حالة استخدام الخلايا الليفية للقلفة البشرية (HFFs) ، قم بزرع 20,000 خلية / بئر.
3. عادة ، يجب زرع 21 بئرا (7 بئر في 3) لكل عينة ، مما يسمح بتحليل 4 عينات لكل لوحة.
4. قم بزرع 12 بئرا إضافية لكل صفيحة (أي الصف 8) لتكون بمثابة ضوابط.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الفيروس: مخاليط الأجسام المضادة

1. أضف 90 ميكرولتر من الوسائط جنبا إلى جنب مع الجسم المضاد (ومختلطة جيدا) لإنشاء ضعف تركيز الجسم المضاد الأولي المطلوب في 3 آبار من الصف 1 من صفيحة 96 بئر جديدة (لوحة "التخفيف").
   ملاحظه: سيكون التركيز الأولي النموذجي للجسم المضاد 20 ميكروغرام / مل ولكن يجب تحديده تجريبيا.
2. أضف 60 ميكرولتر من الوسائط إلى كل من الآبار ال 18 أدناه (أي 6 بمقدار 3 عبر) الآبار الثلاثة من الخطوة 2.1.
3. أضف 60 ميكرولتر من الوسائط إلى 12 بئرا إضافيا (أي الصف 8).
4. انقل 30 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة من الصف 1 إلى الآبار المقابلة في الصف 2.
5. امزج محتويات الصف 2 عن طريق سحب العينات بسلاسة لأعلى ولأسفل 20 مرة باستخدام الماصة متعددة القنوات.
6. انقل 30 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة من الصف 2 إلى الصف 3.
7. كرر عملية الخلط والنقل هذه حتى يتم خلط محتويات الصف 7.
8. بمجرد خلط الصف 7 ، تخلص من 30 ميكرولتر من الآبار في الصف 7.
9. قم بتخفيف HCMV في وسط كامل بحيث يحتوي 50 ميكرولتر على جزيئات معدية كافية لتؤدي إلى عدوى MOI = 1 إذا تمت إضافتها مباشرة إلى الخلايا.
   ملاحظه: HCMV هو أحد مسببات الأمراض من فئة السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL-2). تأكد من وجود إجراءات السلامة المناسبة واستخدم نصائح المرشح لجميع الوسائط المعرضة ل HCMV.
   ملاحظه: يتطلب هذا نفس عدد الجسيمات المعدية مثل الخلايا / البئر ، والتي ستختلف بناء على نوع الخلية والانتحاء للفيروس. في حالة استخدام HFFs كما هو موضح أعلاه ، فإن تركيز الفيروس المطلوب هو 4x10⁵ pfu / mL.
   ملاحظه: تأكد من تحضير فائض كاف من الفيروس المخفف (على سبيل المثال ، 10٪ إضافية).
10. أضف 60 ميكرولتر من مخزون الفيروس المخفف إلى جميع الآبار التي تحتوي على تخفيفات الأجسام المضادة ، و 6 آبار تحتوي على 60 ميكرولتر فقط من الأوساط.
11. أضف 60 ميكرولتر من الوسائط فقط إلى 6 آبار متبقية من الوسائط فقط ، لتكون بمثابة عناصر تحكم غير مصابة.
12. احتضان الفيروس الناتج: مخاليط الأجسام المضادة عند 37^{درجة مئوية}لمدة 1 ساعة.

< p class = "jove_title" >3. إصابة الخلايا المستهدفة

1. قم بإزالة جميع الوسائط من الخلايا المستهدفة.
2. باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل 100 ميكرولتر من خليط الفيروس: الجسم المضاد من لوحة "التخفيف" إلى الخلايا في الموضع المكافئ على لوحة "الهدف".
3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.

< p class = "jove_title" >4. تثبيت الخلايا

1. قم بإزالة جميع الوسائط من الخلايا.
   ملاحظه: ليست هناك حاجة لتغيير الأطراف بين الآبار في هذه المرحلة.
2. اغسل جميع الآبار بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 200 ميكرولتر (PBS) وقم بإزالته.
3. أضف 180 ميكرولتر -20 ^درجةمئوية ، 100٪ إيثانول لجميع الآبار.
4. احتضان الطبق عند -20 ^{درجة مئوية}لمدة 30 دقيقة على الأقل
   ملاحظه: يمكن تمديد هذه الخطوة إلى شهر واحد على الأقل ، بشرط إضافة إيثانول إضافي عندما يبدأ في التبخر.
   ملاحظه: اللوحة آمنة للتعامل معها في ظل ظروف BSL-1 من هذه النقطة فصاعدا ، ويمكن استخدام أطراف غير مرشحة.

< p class = "jove_title" >5. الكشف عن الخلايا المصابة بالفيروسات عن طريق التألق المناعي (IF)

1. قم بإزالة الإيثانول من اللوحة.
2. اغسل جميع الآبار ب 200 ميكرولتر PBS وقم بإزالتها.
3. أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى جميع الآبار واحتضنه لمدة 5 دقائق.
   1. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد تخفيف الأجسام المضادة الأولية في PBS.
   ستكون
   2. هناك حاجة إلى 100 ميكرولتر من 1: 2000 ماوس أحادي النسيلة مضاد ل IE لكل بئر (لاحظ أن التخفيف مخصص للجسم المضاد المحدد المدرج في المواد).
      ملاحظة: قد يحتاج تخفيف الجسم المضاد المستخدم ل IF إلى التحسين إذا تم استخدام بديل.
   3. خليط دوامة لضمان الخلط الكافي.
4. قم بإزالة PBS من جميع الآبار وأضف 100 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة الأولية.
5. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
6. إزالة الجسم المضاد الأولي من جميع الآبار.
7. أضف 200 ميكرولتر من PBS واحتضنه لمدة 5 دقائق.
   1. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد الجسم المضاد الثانوي وتخفيف 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) في PBS.
   ستكون
   2. هناك حاجة إلى 100 ميكرولتر من 1: 2000 IgG مضاد للفأر المترافق بالفلوروفور و 1 ميكروغرام / مل DAPI لكل بئر.
   3. ملاحظة: قد يحتاج تخفيف الجسم المضاد الثانوي المستخدم ل IF إلى التحسين إذا تم استخدام بديل.
   4. خليط دوامة لضمان الخلط الكافي.
8. قم بإزالة PBS من جميع الآبار وأضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية / تخفيف DAPI.
9. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، محمية من الضوء.
10. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي / DAPI من جميع الآبار.
11. اغسل جميع الآبار ب 200 ميكرولتر PBS وقم بإزالتها.
12. أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى جميع الآبار واحتضنه لمدة 5 دقائق.
13. قم بإزالة PBS وأضف 100 ميكرولتر من PBS إلى جميع الآبار وقم بتخزينها ، محمية من الضوء ، عند 4 ^درجاتمئوية حتى تصبح جاهزة للتصوير.
    ملاحظه: يمكن تخزين اللوحات لمدة تصل إلى شهر واحد مع الحد الأدنى من الخسارة في جودة الإشارة / الصورة.

< p class = "jove_title" >6. تصوير وعد الخلايا المصابة

1. لتحديد العدوى بسهولة ودقة ، قم بتصوير ما لا يقل عن 25٪ من كل بئر ، في كل من القنوات الزرقاء (DAPI ، النوى) والجسم المضاد الثانوي (بروتينات HCMV الفورية المبكرة (IE)><). ملاحظه: يجب أن تشبه الإشارة الناتجة عن التألق المناعي IE إشارة التلوين النووي ويجب التحقق من الصور لتأكيد ذلك.
2. يمكن إجراء ذلك يدويا ، ولكن ينصح باستخدام المجهر الآلي.
   ملاحظه: سيعتمد التكبير على الأداة الخاصة بك ، ولكن نظرا لتصوير الهياكل الكبيرة (النوى) ، عادة ما تكون أهداف 4X / 10X كافية.
3. بمجرد الحصول على الصور ، قم بمعالجتها من خلال برنامج تحليل البرنامج الذي تختاره.
   1. أولا ، حدد النوى عبر القناة الزرقاء ، لحساب عدد الخلايا الموجودة.
   تحتاج
   2. هذه المناطق فقط بعد ذلك إلى التحقق من وجود إشارة في القناة الحمراء ، حيث أن IE هو بروتين موضعي نووي ، لحساب عدد الخلايا المصابة.
4. بمجرد حساب عدد الخلايا المصابة والعدد الإجمالي للخلايا ، احسب النسبة المئوية للإصابة على أساس كل بئر.
5. يمكن تصحيح هذه القيم لمستويات الكشف في الخلفية عن طريق طرح متوسط النسبة المئوية للعدوى التي لوحظت في الآبار غير المصابة من جميع الآبار الأخرى.
   ملاحظه: يجب أن يكون هذا أقل بكثير من 1٪. إذا كانت أكثر من 1٪، فإن إجراء التحليل يتطلب التحسين.
6. يمكن الآن رسم هذه القيم المصححة في الخلفية واستجوابها وتحليلها حسب الرغبة.

المواد