$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. الاقتران التساهمي للأجسام المضادة الملتقطة بالكريات المجهرية MagPlex
يتم اقتران كل جسم مضاد للالتقاط مع مجموعة مجهرية مغناطيسية كربوكسية محددة باستخدام إجراء من خطوتين كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: تتوفر أيضا مجموعة أدوات التوصيل بما في ذلك جميع الكواشف والمخازن المؤقتة والمواد المطلوبة لاقتران الكرة المجهرية (انظر جدول المواد).
- أعد تعليق المخزون المعلق المجهري غير المقترن وفقا للتعليمات الموضحة في ورقة معلومات المنتج المتوفرة مع الكرات المجهرية الخاصة بك.
ملاحظه: تعتمد تعليمات إعادة التعليق على حجم وحجم قوارير الكرة المجهرية الخاصة بك.
- نقل 2.5 × 106 من الكريات المجهرية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الموصى به (انظر جدول المواد).
- ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي واترك الفصل يحدث لمدة 60 ثانية.
- مع استمرار وضع الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية. < / >
ملاحظه: احرص على عدم إزعاج الكريات المجهرية.
- قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الكريات المجهرية في 100 ميكرولتر من dH2O عن طريق الدوامة والصوتنة لمدة 20 ثانية.
- كرر الخطوتين 3 و 4.
- قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الكريات المجهرية المغسولة 80 ميكرولتر من 0.1 م فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ، درجة الحموضة 6.2 عن طريق الدوامة والصوتنة لمدة 20 ثانية.
- أضف 10 ميكرولتر من 50 مجم / مل N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) (مخفف في 0.1 M فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ، درجة الحموضة 6.2) إلى الكريات المجهرية واخلطها برفق بواسطة دوامة.
- أضف 10 ميكرولتر من 50 مجم / مل 1-إيثيل -3- [3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل] كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) (مخفف في 0.1 م فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ، درجة الحموضة 6.2) إلى الكرات المجهرية واخلطها برفق بواسطة دوامة.
- احتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الخلط اللطيف بواسطة الدوامة كل 10 دقائق.
- ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي واترك الفصل يحدث لمدة 60 ثانية.
- مع استمرار وضع الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية. < / >
ملاحظه: احرص على عدم إزعاج الكريات المجهرية.
- قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الكريات المجهرية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 250 ميكرولتر (PBS) ، ودرجة الحموضة 7.4 عن طريق الدوامة والصوتنة لمدة 20 ثانية تقريبا.
- ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي واترك الفصل يحدث لمدة 60 ثانية.
- مع استمرار وضع الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية. < / >
ملاحظه: احرص على عدم إزعاج الكريات المجهرية.
- كرر الخطوات من 13 إلى 15 ليصبح المجموع غسلتين.
- قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الكريات المجهرية المنشطة والمغسولة في 100 ميكرولتر من PBS ، ودرجة الحموضة 7.4 عن طريق الدوامة والصوتنة لمدة 20 ثانية تقريبا.
- أضف 12.5 ميكروغرام من الجسم المضاد الملتقط إلى الكريات المجهرية المعلقة (أي 5 ميكروغرام / 1 مليون كرة مجهرية).
ملاحظه: تفضل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للالتقاط ولكن يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة < / >
ملاحظة: عادة ما يكون أداء 5 ميكروغرام من البروتين لكل 1 مليون حبة جيدا ولكننا نوصي بمعايرة الكمية لتحقيق أداء الفحص الأمثل.
- ارفع الحجم الإجمالي إلى 500 ميكرولتر مع PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4.
- امزج تفاعل الاقتران بواسطة دوامة.
- احتضان لمدة 2 ساعة مع الخلط عن طريق الدوران في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي واترك الفصل يحدث لمدة 60 ثانية.
- مع استمرار وضع الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية
ملاحظه: احرص على عدم إزعاج الكريات المجهرية.
- قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الكريات المجهرية المقترنة في 1 مل من PBS ، درجة الحموضة 7.4 التي تحتوي على 0.02٪ توين -20 ، 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، 0.05٪ أزيد الصوديوم (PBS-TBN) عن طريق الدوامة والصوتنة لمدة 20 ثانية.
- ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي واترك الفصل يحدث لمدة 60 ثانية.
- مع استمرار وضع الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية. < / >
ملاحظه: احرص على عدم إزعاج الكريات المجهرية.
- كرر الخطوات من 24 إلى 26 لإجمالي غسلتين.
- قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الكريات المجهرية المقترنة في 500 ميكرولتر من PBS-TBN.
ملاحظه: حدد عدد الكريات المجهرية المستردة باستخدام عداد الخلايا أو مقياس كثافة الدم.
- قم بتخزين الكرات المجهرية المقترنة في الثلاجة عند 2-8 درجات مئوية في الظلام.
ملاحظه: يتوفر أيضا بروتوكول لتأكيد كفاءة التوصيل.
< p class = "jove_title" >
2. وسم البيوتين للكشف عن الأجسام المضادة
- تم تصنيف الأجسام المضادة للكشف بالبيوتين باستخدام EZ-Link sulfosuccinimidyl-6- (البيوتيناميدو) هيكسانوات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع زيادة مولار بمقدار 20 ضعفا من كاشف البيوتين لتحقيق 4-6 مجموعات من البيوتين لكل جزيء جسم مضاد.
ملاحظه: عادة ما تستخدم الأجسام المضادة متعددة النسيلة للكشف ، ولكن يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إذا كانت خاصة بحتمة مختلفة عن الجسم المضاد الملتقط.
ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأجسام المضادة الحيوية المتاحة تجاريا للكشف عنها.
فئة
3. الكشف عن الكائنات الحية عن طريق المقايسة المناعية لساندويتش الالتقاط متعدد الإرسال
تستخدم مجموعات الكرة المجهرية المقترنة والأجسام المضادة للكشف المسمى التي تم إنشاؤها في 1 و 2 أعلاه في مقايسة مناعية شطيرة التقاط متعددة الإرسال للكشف عن البكتيريا الموجودة في العينة وتحديدها. يتم عرض نظرة عامة على سير عمل الفحص في الشكل 1.
- حدد قوارير مخزون مجموعات حبات MagPlex المقترنة بالأجسام المضادة من تخزين 2-8 درجة مئوية.
- دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
- قم بإعداد مزيج حبة متعدد الإرسال بحيث تكون كل مجموعة حبة بتركيز نهائي يبلغ 2500 كرة مجهرية لكل 50 ميكرولتر لكل تفاعل بئر (50,000 حبة / مجموعة / مل) في PBS-TBN.
ملاحظه: استخدم جدول بيانات لتحديد معلمات التحضير لمزيج حبة العمل.
ملاحظه: يمكن أيضا تضمين حبات التحكم الداخلي (RP1 Monitor Microspheres) لمراقبة أداء الفحص والأداة.
- ماصة 50 ميكرولتر من خليط حبة العمل في الآبار المناسبة للوحة 96 بئرا.
- الماصة 50 ميكرولتر من المعيار أو العينة إلى الآبار المناسبة.
- ماصة 50 ميكرولتر من PBS-TBN لكل خلفية جيدا.
- قم بتغطية اللوحة بختم رقائق معدنية لحماية الخرزات من الضوء واحتضانها على شاكر اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع الرج عند 800 دورة في الدقيقة.
- ضع اللوحة على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة 1 دقيقة.
- احتفظ باللوحة على فاصل اللوحة المغناطيسية ، قم بإزالة الرقاقة بعناية وقلب اللوحة لتفريغ الآبار ، ثم اضغط لتجف على طبقة سميكة من المناشف الورقية للمختبر 3-4 مرات.
ملاحظه: بدلا من ذلك، قم بسحب الآبار يدويا باستخدام ماصة متعددة القنوات أو استخدم غسالة الألواح الآلية.
- استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 200 ميكرولتر من PBS-TBN إلى كل بئر ورجها لمدة دقيقة واحدة على شاكر اللوحة عند 800 دورة في الدقيقة.
- ضع اللوحة على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة 1 دقيقة.
- احتفظ باللوحة على فاصل اللوحة المغناطيسية ، اقلب اللوحة لتفريغ الآبار ، ثم اضغط لتجف على طبقة سميكة من المناشف الورقية للمختبر 3-4 مرات.
ملاحظه: بدلا من ذلك، قم بسحب الآبار يدويا باستخدام ماصة متعددة القنوات أو استخدم غسالة الألواح الآلية.
- كرر الخطوات من 10 إلى 12 ليصبح المجموع غسلتين.
ملاحظه: قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت قبل الانتقال إلى الخطوة التالية لتجنب التخفيف المحتمل للتفاعل.
- استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من مخزن الفحص المؤقت إلى كل بئر ورجها لمدة دقيقة واحدة على شاكر اللوحة عند 800 دورة في الدقيقة.
- تمييع الجسم المضاد للكشف عن البيوتينيل إلى 4 ميكروغرام / مل في PBS-TBN.
- أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف المخفف إلى كل بئر.
- قم بتغطية اللوحة بختم رقائق معدنية لحماية الخرزات من الضوء واحتضانها على شاكر اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع الرج عند 800 دورة في الدقيقة.
- ضع اللوحة على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة 1 دقيقة.
- احتفظ باللوحة على فاصل اللوحة المغناطيسية ، اقلب اللوحة لتفريغ الآبار ، ثم اضغط لتجف على طبقة سميكة من المناشف الورقية للمختبر 3-4 مرات.
ملاحظه: بدلا من ذلك، قم بسحب الآبار يدويا باستخدام ماصة متعددة القنوات أو استخدم غسالة الألواح الآلية.
- اغسل كل بئر مرتين باتباع الإجراء الموضح في الخطوات 10-12.
ملاحظه: قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت قبل الانتقال إلى الخطوة التالية لتجنب التخفيف المحتمل للتفاعل.
- استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من مخزن الفحص المؤقت إلى كل بئر ورجها لمدة دقيقة واحدة على شاكر اللوحة عند 800 دورة في الدقيقة. ستربتافيدين ، R-Phycoerythrin Contringate (SAPE).
- قم بتخفيف محضر SAPE إلى 4 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت للفحص.
- أضف 50 ميكرولتر من SAPE المخفف إلى كل بئر.
- قم بتغطية اللوحة بختم رقائق معدنية لحماية الخرز و SAPE من الضوء واحتضانها على شاكر اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع الرج عند 800 دورة في الدقيقة.
- ضع اللوحة على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة 1 دقيقة.
- احتفظ باللوحة على فاصل اللوحة المغناطيسية ، اقلب اللوحة لتفريغ الآبار ، ثم اضغط لتجف على طبقة سميكة من المناشف الورقية للمختبر 3-4 مرات.
ملاحظة: بدلا من ذلك، قم بسحب الآبار يدويا باستخدام ماصة متعددة القنوات أو استخدم غسالة الألواح الآلية.
- اغسل كل بئر مرتين باتباع الإجراء الموضح في الخطوات 10-12.
- أضف 100 ميكرولتر من PBS-TBN إلى كل بئر ورجه لمدة دقيقة واحدة على شاكر اللوحة عند 800 دورة في الدقيقة.
- قم بتحليل 50 ميكرولتر من كل تفاعل على محلل Luminex (وفقا لدليل المستخدم للمحلل المستخدم) ، واجمع ما لا يقل عن 50 حبة لكل مجموعة حبة للتحليل. يتم توفير وصف موجز ل xMAP INTELLIFLEX® أدناه.
- حدد القائمة المنسدلة في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة وانتقل إلى تكوين اللوحة.
- حدد تشغيل اللوحة.
- حدد أيقونة إخراج لإخراج حامل اللوحة.
- قم بتحميل اللوحة على حامل اللوحة وحدد أيقونة سحب لسحب حامل اللوحة.
- حدد أيقونة التشغيل لتشغيل اللوحة.
