عزل وهضم البروتينات العدلات

الملخص

< p class = "jove_content" >

يوضح هذا الفيديو عزل البروتين عن العدلات ، والتي تتم معالجتها وهضمها إلى ببتيدات أصغر. يمكن استخدام هذه الببتيدات للتحليل المستقبلي.

البروتوكول

فئة < p = "jove_title" >1. جمع خلايا العدلات وتحللها

1. اجمع خلايا HL60 المتمايزة بالعدلات في أنبوب سعة 15 مل عن طريق طرد عينات بالطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. < / > ملاحظه: يجب أن تكون العدلات عند التقاء 3.5 × 10⁵ خلايا / مل بعد التمايز. حصاد ما يقرب من خمسة ملايين خلية لاستخراج البروتين الكلي.
2. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 15 مل من المحلول المخزن بالفوسفات (PBS) إلى الأنبوب.
3. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
4. كرر الخطوات من 1.2 إلى 1.3.
   ملاحظه: يمكن تجميد عينات الخلايا بالنيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية بعد الخطوة 1.4 ، اعتمادا على الإطار الزمني التجريبي.
5. أضف 300 ميكرولتر من الرقم الهيدروجيني البارد 100 ملي مولار تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (Tris-HCl) الرقم الهيدروجيني 8.5 الذي يحتوي على قرص كوكتيل مثبط البروتيناز (PIC) لكل عينة.
6. عينات دوامة لفترة وجيزة.
7. أضف 1/10 حجم 20٪ من SDS إلى التركيز النهائي البالغ 2٪ من الكثافة القياسية للعيانين.
8. لتحليل عينات الخلايا ، قم بفحص عينات صوتنة في حمام جليدي لمدة 30 ثانية و 30 ثانية لمدة خمس دورات بقوة 10٪.
9. عينات أجهزة الطرد المركزي في دورة قصيرة (السرعة القصوى لمدة 5-10 ثوان).
   ملاحظه: لا تدع حطام الخلية بيليه. استخدم دورانا قصيرا لجمع الرذاذ من جدران الأنبوب.
10. نقل العينات من أنبوب 15 مل إلى أنبوب سعة 2 مل.
11. أضف 1/10 حجم من مخزون 1 M Dithiothreitol (DTT) إلى التركيز النهائي البالغ 10 ملي مولار DTT.
12. عينات دوامة لفترة وجيزة.
13. احتضان العينات لمدة 10 دقائق مع الرج عند 800 دورة في الدقيقة عند 95 درجة مئوية.
14. بعد 10 دقائق ، تبرد العينات إلى درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظه: يمكن وضع العينات في الثلج لتسريع عملية التبريد.
15. أضف 1/10 حجم 0.55 ملي مولار يودوأسيتاميد (IAA) إلى تركيز نهائي قدره 55 ملي مولار IAA.
    ملاحظه: قم بتنفيذ الخطوة 1.15 في الظلام لتجنب تعريض IAA للضوء.
16. عينات دوامة لفترة وجيزة.
17. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام.
18. أضف الأسيتون المثلج بنسبة 100٪ بتركيز نهائي 80٪ وقم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية طوال الليل. < / > ملاحظه: يمكن التخزين عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين إذا لزم الأمر.

< p class = "jove_title" >2. هضم بروتينات العدلات

1. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 13,500 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لترسيب كريات الخلية.
2. تخلص من المادة الطافية واغسل كريات الخلايا ب 500 ميكرولتر من 80٪ من الأسيتون المثلج.
3. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 13,500 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، وإزالة المواد الطافية.
4. كرر الخطوات من 2.1 إلى 2.3.
5. الكريات الجافة بالهواء.
6. بمجرد أن يجف ، أضف 100 ميكرولتر من 8 M Urea / 40 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) إلى الحبيبات الخلوية وسونيكات الماء في حمام مائي 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية متقطعة ، لمدة 15 دورة لإعادة حل كريات البروتين.
7. باستخدام فحص التربتوفان في مصل الدم البقري (BSA) (أو ما يعادله) يحدد تركيز البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
8. أضف 300 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم (ABC) لتخفيف العينة إلى تركيز نهائي يبلغ 2 M Urea.
9. لهضم 50 ميكروغرام من البروتين ، أضف 1:50 Trypsin / LysC (نسبة الإنزيم إلى البروتين) إلى العينات الموجودة على الثلج - امزج العينات عن طريق النقر برفق.
10. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة طوال الليل لإجراء عملية الهضم.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تمايز سير عمل خلايا HL60 إلى عدلات من أجل التنميط البروتيني القائم على قياس الطيف الكتلي. تم زراعة خطوط خلايا HL60 غير المتمايزة والمتمايزة (عبر التحفيز الكيميائي DMSO) وجمعها ومعالجتها لاستخراج البروتين الكلي. تم هضم البروتينات باستخدام Trypsin / LysC ، وتم تنقية الببتيدات باستخدام أطراف C18 STAGE ، متبوعة بالكشف عن طريق LC-MS / MS. تم استخدام MaxQuant و Perseus لتحليل البيانات. ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 15 مل أنبوب فالكون VWR هاتف: 470225-000 25 مل مصلي فيشر ساينتيك 14955235 بيكربونات الأمونيوم (ABC) ثيرموفيشر العلمي أ643-500 أسيتون سيجما ألدريتش 34850-1 لتر طقم فحص BSA VWR CA62408-940 جهاز طرد مركزي 5810 R سيجما ألدريتش EP022628188 ديثيوثريتول (DTT) ثيرموفيشر العلمي R0861 تحضير 1 متر من مخزون DTT وتخزينها في -20 درجة مئوية مصل الأبقار الجنينية (FBS) ثيرموفيشر العلمي 12483020 قم بإذابة الثلج وإعداد الحصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية كتلة التدفئة هيبس سيجما ألدريتش إتش 3375 تحضير 8M Urea / 40M HEPES ، وتخزينها في -20 درجة مئوية يودوأسيتاميد (IAA) فيشر ساينتيك AAA1471514 قم بإعداد 0.55 مليون مخزون من حصص IAA وتخزينها عند -20 درجة مئوية. تجنب التعرض للضوء ل-جلوتامين فيشر ساينتيك 25030081 قم بإذابة الثلج وإعداد الحصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية النيتروجين السائل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة LoBind إيبندورف 13-698-794 البنسلين ستربتومايسين ، أمفوتريسين سيجما ألدريتش أ 5955 قم بإذابة الثلج وإعداد الحصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية خلايا HL60 المتمايزة بالعدلات محلول مخزن بالفوسفات (PBS) بيوشوب برنامج تلفزيوني 408 يحفظ في درجة حرارة الغرفة مسبار سونيكاتير فيشر ساينتيك 100-132-894 قرص كوكتيل مثبط للبروتياز (PIC) سيجما ألدريتش 5892791001 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية RPMI 1640 ثيرموفيشر العلمي 11875093 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ثيرموفيشر العلمي J18220. أ 1 تحضير حل SDS بنسبة 2٪ جهاز الطرد المركزي SpeedVac إيبندورف 07-748-15 قوارير T75 ثيرموفيشر العلمي 156499 تريس حمض الهيدروكلوريك 8.5 فيشر ساينتيك ص ب 152-1 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حمام بالموجات فوق الصوتية VWR 97043-960 يوريا بيوشوب URE001.1