إجراء تلميح المرحلة لتحلية وتنقية الببتيدات

الملخص

< p class = "jove_content" >

يوضح هذا الفيديو تنقية الببتيد من خلال إجراء STAGE Tip. يسهل العمود المصغر الذي يحتوي على حبات راتينج مرتبطة بسلاسل هيدروكربونية طويلة التنقية القائمة على التفاعل الكارهة للماء. عند تحميل عينة ببتيد مهضومة مسبقا في العمود ، ترتبط شظايا الببتيد بخرز الراتنج ، مما يسمح للشوائب بالمرور. يتم تطبيق مخزن مؤقت للشطف يعطل التفاعل الكارهة للماء لتصفية شظايا الببتيد.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تنقية وتحلية الببتيدات

1. قم بتعبئة ثلاث طبقات من راتنج C18 في طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لكل عينة ببتيد لبناء طرف STop And Go Extraction (STAGE).
2. أضف محلول إيقاف 1/10 (20٪ أسيتونيتريل [ACN)] و 6٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك [TFA]) إلى العينات.
3. عينات أجهزة الطرد المركزي لهطول الأمطار الحبيبات عند 13,200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
4. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 2 مل وتخلص من الحبيبات.
5. اغسل أطراف المرحلة ب 100 ميكرولتر من 100٪ ACN.
6. نصائح جهاز الطرد المركزي STAGE عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة < br / > ملاحظه: نصائح جهاز الطرد المركزي STAGE حتى يمر كل السائل عبر راتنج C18.
7. اغسل أطراف STAGE باستخدام 50 ميكرولتر Buffer B (80٪ ACN ، 0.5٪ حمض الخليك ، و ddH₂O).
8. أطراف جهاز الطرد المركزي STAGE عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة.
9. اغسل أطراف STAGE باستخدام 200 ميكرولتر Buffer A (2٪ ACN ، 0.1٪ TFA ، 0.5٪ حمض الخليك ، و ddH₂O).
10. نصائح مرحلة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة.
11. قم بتحميل العينات في نصائح STAGE.
12. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 3-5 دقائق.
13. اغسل أطراف STAGE باستخدام 200 ميكرولتر Buffer A.
14. جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 3-5 دقائق.
15. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت B إلى كل طرف STAGE
16. باستخدام حقنة ، قم بمسح العينات التي تحتوي على Buffer B في أنبوب شريط PCR سعة 0.2 مل.
17. بمجرد تصفية العينات ، جفف الببتيدات باستخدام جهاز طرد مركزي مفرغ لمدة 45 دقيقة.
18. بمجرد أن تجف العينات ، قم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى MS.
    ملاحظه: إذا كانت هناك حاجة إلى تخزين الببتيد لأكثر من أسبوعين ، فإننا نقترح التخزين عند -20 درجة مئوية.
19. قم بتشغيل العينة على مطياف كتلي عالي الدقة (MS).
    ملاحظه: تعتمد معلمات قياس العينة (على سبيل المثال ، كمية العينة المحملة ، وطول التدرج الكروماتوغرافيا السائلة ، والدقة) على الأجهزة المستخدمة.

< p class = "jove_title" >2. التنميط البروتيني للعدلات

1. معالجة البيانات الأولية
   1. قم بتحميل ملفات بيانات Raw التي تم الحصول عليها من MS إلى MaxQuant.
   2. تم تصميم البرنامج للتشغيل مع ملفات الاكتساب المعتمدة على البيانات من الأسفل إلى الأعلى ، ويتم تحسين العديد من المعلمات الافتراضية لمثل هذه العينات. تشمل المعلمات الافتراضية الهضم (Trypsin P) ، والتعديلات المتغيرة لأكسدة الميثيونين (الأكسدة (M)) و N-acetylation للبروتينات (Acetyl (Protein N-term)) ، والتعديلات الثابتة للكارباميدوميثيل للسيستين (كارباميدوميثيل (C)).
   3. تتضمن التعديلات على هذه المعلمات القياس الكمي الخالي من الملصقات (LFQ ؛ تعيين الحد الأدنى لعدد النسبة إلى 1) ، والمطابقة بين الأشواط (أي التشغيل / الإيقاف) ، والحد الأدنى لعدد الببتيدات المحددة لكل بروتين (يوصى بالضبط على 2).
   4. في المعلمات العامة، قم باستيراد ملف FASTA لتحديد التسلسل. في هذه التجربة ، تم استخدام ملف Homo sapiens (Human) (UP000005640) FASTA من قاعدة بيانات Uniprot. ملاحظه: سجل المعلومات التالية لحفظ السجلات: معرف الكائن الحي = 9606; عدد البروتينات = 79،740 ؛ تاريخ تنزيل الملف.
   5. قم بتعيين عدد مراكز الكمبيوتر التي سيتم استخدامها للمعالجة وحدد ابدأ.
   6. عند الانتهاء من MaxQuant ، سيتم إنشاء مجلد "مدمج" ، إلى جانب ملفات أخرى.
      ملاحظه: يمكن استخدام الملفات الأخرى لتحديد الببتيدات والتعديلات وما إلى ذلك ، وقد تكون هناك حاجة لتحميل مجموعة البيانات الكاملة إلى مستودعات البيانات ، بما في ذلك Proteome Xchange (PRIDE).
2. تحليل البيانات وتصورها في Perseus
   1. قم بتحميل "proteingroups.txt" في Perseus وحدد جميع ملفات كثافة LFQ للنافذة "الرئيسية".
      ملاحظه: يتم استيراد معلومات خط الأساس مباشرة إلى نوافذ Perseus ، ولكن قد يلزم إضافة معلومات أخرى (مثل مواقع التعديل) يدويا.
   2. قم بتصفية الصفوف عن طريق إزالة الملوثات والببتيدات العكسية والببتيدات التي يتم تحديدها فقط حسب الموقع.
   3. تحويل البيانات عن طريق السجل₂ (x).
   4. لمراقبة عدد البروتينات المكتشفة في كل تكرار ، قم بإنشاء مخطط Venn رقمي.
   5. قم بتعيين التعليقات التوضيحية الفئوية لكل عينة.
      ملاحظه: لأغراض إحصائية ، يجب أن تحمل جميع النسخ المتماثلة لعينة بيولوجية واحدة نفس الاسم.
   6. قم بتصفية الصفوف بناء على قيم صالحة ، مع تحديد البروتين في >50٪ من التكرارات وضمن مجموعة واحدة على الأقل.
      ملاحظه: يمكن أن تكون التصفية حسب القيم الصالحة أكثر صرامة ، اعتمادا على إعداد التجربة وأهدافها (على سبيل المثال ، يجب أن يكون البروتين موجودا في جميع العينات).
   7. لاستبدال القيم المفقودة ل LFQ ، يمكن إجراء الاحتساب من التوزيع العادي.
      ملاحظة: تم تحسين المعلمات الافتراضية لبيانات LFQ ولكن يمكن تعديلها حسب الرغبة.
   8. أضف معلومات التعليقات التوضيحية إلى صفوف البروتين. أضف ملف txt.gz FASTA (تم الحصول عليه من موقع Perseus) في مجلدات "bin" و "conf" و "annotation" وأحضر مصطلحات محددة (على سبيل المثال ، أسماء البروتين وأسماء الجينات وأنطولوجيا الجينات).
   9. اكتملت المصفوفة الآن ويمكن استخدامها للاختبار الإحصائي (على سبيل المثال ، ANOVA ، اختبارات t) لتحديد التغييرات المهمة في وفرة البروتين بين الظروف المختبرة. تشمل الأشكال الأخرى لأدوات التصور مخططات تحليل المكونات الرئيسية والخرائط الحرارية وإثراء الفئة.
      ملاحظه: يمكن أيضا تنزيل معلومات التعليقات التوضيحية من UniProt ودمجها في إطار عمل Perseus.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 15 مل أنبوب فالكون VWR هاتف: 470225-000 25 مل مصلي فيشر ساينتيك 14955235 بيكربونات الأمونيوم (ABC) ثيرموفيشر العلمي أ643-500 حمض الخليك سيجما ألدريتش 1099510001 أسيتون سيجما ألدريتش 34850-1 لتر الأسيتونيتريل (ACN) ، درجة MS ثقب تي إس -51101 طقم فحص BSA VWR CA62408-940 أقراص C18 (تلميحات STAGE) فيشر ساينتيك 13110019 جهاز طرد مركزي 5810 R سيجما ألدريتش EP022628188 ديثيوثريتول (DTT) ثيرموفيشر العلمي R0861 تحضير 1 متر من مخزون DTT وتخزينها في -20 درجة مئوية مصل الأبقار الجنينية (FBS) ثيرموفيشر العلمي 12483020 قم بإذابة الثلج وإعداد الحصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية هيبس سيجما ألدريتش إتش 3375 تحضير 8M Urea / 40M HEPES ، وتخزينها في -20 درجة مئوية مطياف الكتلة عالي الدقة ثيرموفيشر العلمي 726042 يودوأسيتاميد (IAA) فيشر ساينتيك AAA1471514 قم بإعداد 0.55 مليون مخزون من حصص IAA وتخزينها عند -20 درجة مئوية. تجنب التعرض للضوء ل-جلوتامين فيشر ساينتيك 25030081 قم بإذابة الثلج وإعداد الحصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة LoBind إيبندورف 13-698-794 ماكس كوانت https://www.maxquant.org/ أنابيب شريط PCR VWR 76318-802 البنسلين ستربتومايسين ، أمفوتريسين سيجما ألدريتش أ 5955 قم بإذابة الثلج وإعداد الحصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية فرساوس https://www.maxquant.org/Perseus/ محلول مخزن بالفوسفات (PBS) بيوشوب برنامج تلفزيوني 408 يحفظ في درجة حرارة الغرفة مسبار سونيكاتير فيشر ساينتيك 100-132-894 قرص كوكتيل مثبط للبروتياز (PIC) سيجما ألدريتش 5892791001 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية RPMI 1640 ثيرموفيشر العلمي 11875093 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ثيرموفيشر العلمي J18220. أ 1 تحضير حل SDS بنسبة 2٪ جهاز الطرد المركزي SpeedVac إيبندورف 07-748-15 جهاز طرد مركزي STAGE سونيشن STC-V2 قوارير T75 ثيرموفيشر العلمي 156499 حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ثيرموفيشر العلمي 85183 تريس حمض الهيدروكلوريك 8.5 فيشر ساينتيك ص ب 152-1 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية التربسين / LysC ثيرمو فيشر العلمي أ 40009 يحفظ ويخزن في -20 درجة مئوية حمام بالموجات فوق الصوتية VWR 97043-960 يوريا بيوشوب URE001.1