تقييم الأجسام المضادة الوظيفية المعادلة ل SARS-CoV-2

الملخص

< p class = "jove_content" >

يعرض هذا الفيديو مقايسة تحييد تقيس فعالية المصل في تحييد فيروسات SARS-CoV-2. إنه ينطوي على فيروسات ذات تنمط كاذب ، وتخفيف المصل ، والقياس الكمي القائم على اللمعان ، مما يكشف عن عيار التحييد.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. مقايسة التحييد القائمة على النمط الزائف

ملاحظة: pMN هو تثبيط التحويل بوساطة الفيروس من النوع الكاذب (PV) عبر عينات مصل النقاهة البشرية التي تحتوي على أجسام مضادة موجهة ضد SARS-CoV-2 Spike.

1. في صفيحة بيضاء سعة 96 بئرا بمساعدة ماصة متعددة القنوات، أضف 50 ميكرولتر من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) و 10٪ مصل بقري جنين (FBS) و 1٪ بنسلين/ستربتومايسين (Pen/Streptomycin (Pen/Strepe) إلى الصفوف B إلى H، الأعمدة 1-12.
2. أضف 5 ميكرولتر من مصل النقاهة في آبار الصف A ، الأعمدة 2-10 ، بحجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر DMEM / 10٪ FBS / 1٪ P / S. أضف كمية معروفة (على سبيل المثال ، 5 ميكرولتر) من الإيجابية (NIBSC 20/162 ، HICC-pool 2 أو HICC pool 3) ومضاد مصل سلبي (مصل المريض المأخوذ قبل عام 2019) في الآبار A11 و A12 كعناصر تحكم.
3. قم بإزالة 50 ميكرولتر من آبار الصف A وقم بإجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة أسفل جميع الآبار الموجودة تحتها.
4. مع كل خطوة تخفيف، استخدم ماصة متعددة القنوات للخلط من 5 إلى 10 مرات عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل والحرص على عدم إنتاج فقاعات هواء.
5. بعد الانتهاء من التخفيف التسلسلي ، يجب التخلص من 50 ميكرولتر الأخيرة من البئر النهائي لكل عمود.
   ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن يحتوي كل بئر على 50 ميكرولتر من DMEM المختلط والتخفيفات التسلسلية لأمصال المريض أو مصل التحكم.
6. لوحة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 500 دورة في الدقيقة لضمان عدم ترك أي سائل على جدران البئر.
7. باستخدام البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق المعايرة بالتحليل الحجمي من النوع الكاذب، احسب كمية DMEM المطلوبة لتخفيف SARS-CoV-2 PV للحصول على 5 × 10⁶ RLU في 50 ميكرولتر، بحجم إجمالي يبلغ 5 مل.
8. امزج هذا المحلول الكهروضوئي المخفف في حوض ماصة باستخدام الماصة متعددة القنوات، وقم بإخراج 50 ميكرولتر في كل بئر على اللوحة، باستثناء الآبار A6-A12 (التحكم في الخلية فقط). سيكون A1-A6 بمثابة تحكم كهروضوئي فقط.
9. لوحة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 500 دورة في الدقيقة لضمان عدم ترك أي فيروس على جدران البئر.
10. احتضن الصفائح لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂) ، مما يتيح الوقت للمصل لربط البروتين السكري SARS-CoV-2.
11. قم بإعداد صفيحة من الخلايا المستهدفة HEK 293T / 17 التي تم نقلها قبل 24 ساعة باستخدام بلازميد التعبير عن الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 (ACE2) وبلازميدات البلازميد عبر الغشاء 2 (TMPRSS2).
    1. قم بإزالة وسائط الثقافة من اللوحة.
    2. اغسل الطبق مرتين ب 2 مل من PBS على جانب واحد من الطبق لتجنب انفصال الخلايا والتخلص منها.
    3. أضف 2 مل من التربسين إلى الطبق وضع الطبق في الحاضنة حتى تنفصل الخلايا.
    4. بعد انفصال الخلايا ، أضف 6 مل من DMEM / 10٪ FBS / 1٪ بنسلين / ستربتومايسين إلى اللوحة لإخماد نشاط التربسين وإعادة تعليق الخلايا برفق.
    5. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي TC20^TM أو شريحة غرفة العد وأضف 1 × 10⁴ خلايا بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر لكل بئر.
12. احتضان اللوحة لمدة 48-72 ساعة ، عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
13. اقرأ اللوحة باستخدام نظام فحص Bright Glo^TM luciferase على مقياس الإضاءة Microplate GloMax® Navigator عن طريق إزالة وسط الثقافة من جميع الآبار وإضافة 25 ميكرولتر من مزيج 1: 1 من كاشف فحص PBS: Bright Glo^TM luciferase.
14. من البيانات الأولية التي يوفرها مقياس الإضاءة ، احسب نصف الحد الأقصى للتركيز المثبط (IC50) عيار الأجسام المضادة المعادلة باستخدام البروتوكولات المعمول بها. تعتبر قيم IC50 أقل من 1:40 سالبة. يمكن بدلا من ذلك تقييم البيانات باستخدام AutoPlate.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أطراف ماصة حاجز MultiGuard 1-20 ميكرولتر سورنسون للعلوم البيولوجية 30550 ت أطراف ماصة حاجز MultiGuard 1-200 ميكرولتر سورنسون للعلوم البيولوجية 30550 ت طبق ثقافة الخلايا NuncTM معالج بالسطح دلتا (أطباق معقمة 10 سم) ثيرمو فيشر العلمي هاتف 150350 أحواض الماصة (50 مل) العامه 96 بئر صفيحة بيضاء ثيرمو فيشر ساينتيف 136101 HEK 293T / 17 خلية ATCC رقم التعريف الهاتفي-11268 بلازميد التعبير عن إنزيم الإنجيوتنسين المحول لمستقبلات دخول الخلية المضيفة 2 (ACE2): pCDNA3.1 + -ACE2 سيمونز 2004 Coronavirus Spike (S) بروتين فتيلة عبر الغشاء سيرين بروتياز 2 (TMPRSS2) التعبير عن البلازميد: pCAGGS-TMPRSS2 بيرترام 2010 وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز ، مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S) عموم التكنولوجيا الحيوية P04-04510
P40-37500
P06-07100 كاشف النفداء فوجين® عالي الدقة، 1 مل بروميجا E2311 التربسين EDTA (0.05٪) ، أحمر الفينول عموم التكنولوجيا الحيوية P10-040100 الجسم المضاد للتحكم الإيجابي (كاشف البحث المضاد ل SARS-CoV-2 Ab) الذي يمكنه تحييد SARS-CoV-2 PV (NIBSC ، الرمز: 20/162 ، متوفر دوليا أو HICC-pool 2 / HICC Pool 3) اختبار بلازما النقاهة البشرية COVID-19 نظام فحص Glo luciferase اللامع بروميجا E2650