قياس مستويات الغلوبولين المناعي G مقابل لقاح اختبار في مصل الفأر

الملخص

المصدر: Zeng ، X. et al. ، تقييم الاستجابة المناعية للقاح مساعد للمستحلب النانوي ضد عدوى المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA).J. Vis. Exp.(2023)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتقييم الاستجابة المناعية للجسم المضاد للقاح مساعد جديد للمستحلب النانوي في الفئران المحصنة مسبقا. يعزز التحصين استجابة الأجسام المضادة كما هو مؤكد من خلال تحديد عيار الأجسام المضادة IgG.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. تحضير بروتين مستضد MRSA HI

1. الحصول على استنساخ عامل تحديد سطح أيون الحديد B (IsdB) و α-هيموليسين متحولة (Hla) من مصادر تجارية (انظر جدول المواد) ، وإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم جينات IsdB و Hla ، وربط منتجاتها ببلازميد PGEX-6P-2 (تم الحصول عليها تجاريا ؛ انظر جدول المواد). الشاشة مع المتجه XL / سلالة الأزرق للإشريكية القولونية.
2. قم بتحويل الاستنساخ الإيجابي إلى بكتريا قولونية BL21 خلايا مختصة (انظر جدول المواد) وتضخيمه باستخدام استزراع أسماك القرش.
3. التعبير عن المستضد والعزل بعد الحث باستخدام مجموعات عزل الأيزوبروبيل-β-D-1-mercaptogalactopyranoside والكروماتوغرافيا متعددة الوسائط (MMC) (انظر جدول المواد).
4. قم بتمييز بروتين المستضد وتنقيته باستخدام جهاز تنقية كامل الأتمتة.
   1. تنقية البروتينات الموسومة ب gutathione S-transferase (GST) من المحللات التي تم تطهيرها باستخدام راتنج كروماتوغرافيا التقارب المتاح تجاريا (انظر جدول المواد).
   2. تنقية البروتينات المؤتلفة بواسطة الأيزوبروبيل-β-D-1-mercaptogalactopyranoside والكروماتوغرافيا متعددة الوسائط (MMC).
   3. قم بإزالة السم الداخلي بطريقة فصل طور Triton X-114. باختصار ، امزج 1٪ Triton X-114 مع بروتين مؤتلف يميدر عند 0 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لضمان محلول متجانس ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح بتكوين مرحلتين.
5. استخدم طريقة اختبار السموم الداخلية البكتيرية مع مجموعات السلاحف (انظر جدول المواد) للكشف عن تركيز السموم الداخلية. السم الداخلي لمستضد البروتين هو 0.06 EU / μg ، أقل من المعيار الدولي (1.5 EU / μg).
   1. قم بإجراء اختبار تداخل للتخلص من التأثير المحتمل لمنتج الاختبار على الكشف عن السموم الداخلية. < / > ملاحظه: وفقا للملحق 2020 من دستور الأدوية الصيني ، يجب أن يكون محتوى السموم الداخلية أقل من 5 يورو / جرعة. تم حساب حساسية ليمولوس محلل (λ0.25 EU/mL) والحد الأقصى لنسبة التخفيف الفعالة البالغة 33.3 على أساس الحد الأقصى للتخفيف الصحيح ، MVD = cL / λ ، حيث L هي القيمة الحدية للسموم الداخلية البكتيرية لمقالة الاختبار ، c هي تركيز محلول مادة الاختبار ، وعندما يتم التعبير عن L ب EU / m ، ج يساوي 1.0 ملغم/مل. λ هي الحساسية المسماة (الاتحاد الأوروبي / مل) لكاشف سلطعون حدوة الحصان في طريقة الهلام.
6. أعد تجميع المستضد (48 كيلو دالتون ، يحدده الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد بنسبة 12٪ [SDS-PAGE]) عند 1.5 مجم / مل في ماء معقم بدون سموم داخلية أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (طريقة ثنائي كلورات الصوديوم).
   ملاحظة: كان وقت ذروة البروتين 13.843 دقيقة ، وكان النقاء 99.4٪ (طريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء) ، وتم تخزين البروتين عند -70 درجة مئوية. تم استخدام الحمض النووي الجيني المستخرج من سلالة المكورات العنقودية الذهبية MRSA252 (انظر جدول المواد) كقالب PCR. تم تضخيم جين IsdB باستخدام التمهيدي الأمامي 59-CGCGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
   C-39 والتمهيدي العكسي 59-TTTTCCTTTTGCGG
   CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39.
   تم تضخيم جين Hla باستخدام التمهيدي الأمامي PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATTAAAACC) والتمهيدي العكسي PHLAR (TAAGCGGCCGCTTATATTTGTCATTTCTTC).

< p class = "jove_title" >2. تحضير لقاح المستحلب النانوي

1. وفقا لنسبة الكتلة 1: 6: 3 (وزن / وزن) ، أضف ثلاثة أنواع من السواغات بالتسلسل (إيزوبروبيل ميريستات ، وزيت الخروع بولي أوكسي إيثيلين ، والبروبيلين جلايكول ؛ انظر جدول المواد) إلى محلول بروتين مستضد HI (10 مجم / مل) وحركه جيدا. ثم أضف الماء النقي المعقم تدريجيا للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 10 مل وحركه عند 500 دورة في الدقيقة و 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا.
   ملاحظه: يبلغ حجم المستحلب النانوي المحضر في هذا البروتوكول 10 مل ، وكتل السواغات الثلاثة هي 0.34 جم و 2 جم و 1 جم على التوالي. محلول البروتين هنا هو محلول العمل ، 10 أضعاف تركيز المحلول النهائي.
2. تحضير اللقاح المساعد للمستحلب النانوي (1 مجم / مل بروتين) بطرق استحلاب منخفضة الطاقة للحصول على محلول سائل شفاف وشفاف.
   ملاحظه: تم تحضير المستحلب النانوي الفارغ (BNE) بطرق مماثلة ، باستثناء أنه تم استبدال الماء ب HI. تتضمن طريقة الاستحلاب المعتادة تسخين المرحلتين الخارجية والداخلية إلى حوالي 80 درجة مئوية للاستحلاب ثم تحريكها وتبريدها تدريجيا. في هذه العملية ، يتم استهلاك كمية كبيرة من الطاقة ، وأخيرا يتم الحصول على المستحلب.

< p class = "jove_title" >3. التوصيف الفيزيائي واستقرار اللقاح المساعد للمستحلب النانوي

1. حجم الجسيمات ، وإمكانات زيتا ، وتوصيف مؤشر تشتت البوليمر (PDI).
   1. تحضير 100 ميكرولتر من اللقاح المساعد للمستحلب النانوي وتخفيف 50 ضعفا بالماء للحقن. أضف 2 مل من العينة للكشف عنها.
   2. راقب أحجام الجسيمات وإمكانات زيتا و PDI عند 25 درجة مئوية باستخدام نانو زيتاسيزر (ZS ؛ انظر جدول المواد).
2. الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM)
   1. خفف 10 ميكرولتر من لقاح المستحلب النانوي 50 ضعفا بالماء ، ثم ضعه على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون 100 شبكة ، وصمة عار بحمض الفوسفوتونغستيك 1٪ (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. قم بإزالة محلول حمض الفوسفوتونغستيك الزائد باستخدام ورق الترشيح.
   3. راقب التشكل تحت المجهر الإلكتروني الناقل (انظر جدول المواد). افحص ما إذا كانت المنتجات النهائية مستقرة ودائرية تقريبا في مجال رؤية المجهر الإلكتروني وما إذا كانت تظهر تشتت جيد.
3. الفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM)
   1. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من اللقاح المساعد للمستحلب النانوي 50 ضعفا بالماء ، وقم بإسقاط 10 ميكرولتر من العينات المخففة مسبقا على رقاقة السيليكون ، وضعها في حاضنة يتم التحكم فيها بواسطة منظم الحرارة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
   2. رش البلاتين المحضر على السيليكون لمدة 40 ثانية واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
   3. راقب الخصائص المورفولوجية للعينات المحضرة تحت مجهر إلكتروني ماسح عالي الدقة (انظر جدول المواد). حدد ما إذا كانت العينات شبه مستقرة وكروية ومشتتة جيدا في مجال الرؤية تحت المجهر الإلكتروني.
4. الاستقرار المورفولوجي
   1. ضع 1 مل من عينات لقاح المستحلب النانوي في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، وقم بتقييم ثبات العينات الجديدة عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 13,000 × جم في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).
   2. راقب مظهر هذه العينات الجديدة ثم قم بإجراء اختبار استقرار ديناميكي حراري لست دورات درجة حرارة (دورة واحدة: يخزن في 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة ، و 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ، و 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة).
   3. بعد الطرد المركزي ، اسمح للعينات بالوقوف لمدة 15 دقيقة لتحديد ما إذا كان هناك تأثير تيندال (ما إذا كانت العينة واضحة وشفافة تحت الضوء) وما إذا كان الاستحلاب قد حدث (كما هو موضح من خلال التقسيم الطبقي الواضح بعد إزالة الاستحلاب).
5. SDS-PAGE واللطخة الغربية
   1. هز العينات ، واخلط محلول 0.6 مل من الإيثانول المطلق و 0.3 مل من اللقاح ، وأجهزة الطرد المركزي (13,000 × جم ، 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، 25 درجة مئوية).
   2. انقل المادة الطافية للمحلول إلى أنبوب نظيف وقم بإذابة الراسب ب 0.3 مل من الماء. الحصول على المحاليل الطافية والراسب (كل من المستحلب النانوي الفارغ واللقاح) بعد المعالجة بالإيثانول المطلق ومحلول الماء المقطر ، وإجراء نفس التخفيف 50 ضعفا.
   3. امزج 2.5 مل من هلام الفصل A و 2.5 مل من هلام الفصل B (انظر جدول المواد) ، أضف 50 ميكرولتر من بيرسلفات الأمونيوم بنسبة 10٪ ، وضع المحلول بسرعة في الصفيحة الزجاجية باستخدام ماصة. امزج 1 مل من الجل المركز A و 1 مل من الجل المركز B ، وأضف 20 ميكرولتر من بيرسلفات الأمونيوم بنسبة 10٪ في الصفيحة الزجاجية ، وأدخل مشطا بحجم مناسب ، وانتظر التصلب.
   4. أضف ما مجموعه 5 ميكرولتر من محلول عازلة لتحميل البروتين 5x إلى العينة المخففة التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.5.2 ، واغلي العينة لمدة 5 دقائق.
   5. أضف 10 ميكرولتر من البروتين الساخن إلى البئر المقابل ، وأضف 5 ميكرولتر من علامة البروتين إلى بئر العلامة.
   6. قم بتوصيل القطب الكهربائي ، وقم بتشغيل مقياس الرحلان الكهربائي (انظر جدول المواد) ، واضبط الجهد على 300 فولت ، قم بإيقاف تشغيل الطاقة عندما يصل الرحلان الكهربائي إلى 1 سم بعيدا عن الجزء السفلي من مطاط PAGE.
   7. قم بإزالة الجل واشطفه بالماء المقطر المزدوج (ddH₂O). أضف محلول تلطيخ Coomassie الأزرق الفاتح G-250 (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق. اسكب محلول التلوين ، واشطف الجل مرتين بالمحلول ومحلول إزالة اللون المتاح تجاريا وقم بتسخين الجل في الميكروويف لمدة 1 دقيقة. رج الجل لمدة 10 دقائق ، وقم بتغيير محلول إزالة اللون بشكل متكرر حتى تصبح خلفية الجل واضحة. ثم قم بإجراء تصوير الهلام (انظر جدول المواد).
      ملاحظه: تمت معالجة اللطخة الغربية مسبقا ، كما هو موضح في الخطوات 3.5.1-3.5.6.
   8. انقع ثلاث كتل من ورق الترشيح باستخدام مخزن مؤقت لنقل الرحلان الكهربائي. انقع غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) في الميثانول لمدة 30 ثانية ونقله باستخدام أداة نقل هلام شبه جافة (طبقتان من ورق الترشيح ، وغشاء PVDF ، وهلام الرحلان الكهربائي ، وطبقة واحدة من ورق الترشيح). استخدم جهد 23 فولت لنقل الغشاء لمدة 23 دقيقة.
   9. قم بإزالة غشاء PVDF واغسله مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن مؤقت ثلاثي توين 20 (TBST) بعد النقل.
   10. ضع غشاء PVDF في محلول مانع للتسرب (محلول مسحوق حليب منزوع الدسم بنسبة 5٪) وأغلقه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   11. قم بإزالة غشاء PVDF واغسله ثلاث مرات باستخدام TBST أو 10 دقائق لكل منهما.
   12. احتضان بالجسم المضاد الأساسي (من الفئران المحصنة ذات المصل الإيجابي). تمييع الجسم المضاد الأساسي (انظر جدول المواد) المراد اختباره 500 ضعف (100 ضعف) باستخدام TBST. ضع غشاء PVDF المسدود في الجسم المضاد الأساسي واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة.
   13. قم بإزالة غشاء PVDF واغسله ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 10 دقائق لكل منهما.
   14. احتضان الجسم المضاد الثانوي (انظر جدول المواد). الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر المسمى بالفوسفاتيز القلوي المخفف (AP) 5,000 ضعف مع TBST. ضع غشاء PVDF في الجسم المضاد الثانوي واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
   15. قم بإزالة غشاء PVDF واغسله أربع مرات باستخدام TBST لمدة 10 دقائق لكل منهما.
   16. اغمر أغشية PVDF في خليط (يكفي فقط لامتصاص الغشاء) من ركيزة AP نيترو الأزرق رباعي التترازول (NBT) و BCIP (5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine salt) (انظر جدول المواد) للتلطيخ. النتيجة الإيجابية هي اللون الأرجواني.
       ملاحظة: يجب أن تكون النتائج عبارة عن شريط أرجواني شفاف ، ويجب أن يكون شريط العينة والوزن الجزيئي للمستضد في نفس الموضع المسمى.

< p class = "jove_title" >4. تقييم الاستجابة المناعية للأجسام المضادة لهذا اللقاح بعد الإعطاء العضلي

ملاحظة: تم تحصين الفئران عن طريق الحقن العضلي للقاح المستحلب النانوي بعد تقرير منشور. تم إعطاء الفئران PBS كعنصر تحكم سلبي. في أسبوع واحد بعد الانتهاء من ثلاث تطعيمات ، تم جمع المصل من الفئران. تم تحديد مستويات مصل IgG والفئات الفرعية من IgG1 و IgG2a و IgG2b كميا عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

1. طلاء المستضد: خفف مستضد بروتين HI إلى 10 ميكروغرام / مل بمحلول طلاء وأضفه إلى لوحة ELISA عند 100 ميكرولتر / بئر. احتضن عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
   ملاحظه: يتم تحضير محلول الطلاء عن طريق إذابة 1.6 جم من كربونات الصوديوم اللامائية و 2.9 جم من بيكربونات الصوديوم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
2. الختم: اغسل اللوحة (ثلاث دورات ، كل دورة 300 ميكرولتر). أضف 300 ميكرولتر من محلول الختم إلى كل بئر ، وأغلق الآبار لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظه: يتم تحضير محلول الختم عن طريق إضافة Tween-20 وألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى PBS. محتوى BSA في حل PBST هو 1٪.
3. تخفيف المصل: قم بتخفيف عينة مصل الفئران 100 مرة باستخدام PBST (خذ 3 ميكرولتر من المصل وأضفه إلى 297 ميكرولتر من PBST والدوامة) ، واستخدم 100 ميكرولتر لكل عينة مصل. قم بتخفيف المصل الإيجابي ومصل التحكم السلبي 100 مرة باستخدام PBST عن طريق إضافة 4 ميكرولتر إلى 396 ميكرولتر من PBST ، ثم الخلط عن طريق الدوامة.
4. تخفيف النسبة المزدوجة: أضف 200 ميكرولتر من المصل التجريبي المخفف أعلاه إلى الصف الأول من صفيحة ELISA المطلية ، وأضف 100 ميكرولتر من PBST إلى جميع الآبار باستثناء الصفين الأول و 12. قم بإجراء تخفيف بنسبة 1:2 على التوالي من الصف الأول: اضبط الماصة على 100 ميكرولتر، وانقل 100 ميكرولتر من الصف الأول إلى الصف الثاني، واخلطها مع الماصة 10 مرات.
5. خفف المصل إلى الصف 11 بنسب متعددة وتخلص من 100 ميكرولتر من السائل.
6. أضف المصل السلبي والموجب المخفف إلى الآبار المقابلة في الصف 12 وفقا لقالب العينة (انظر الجدول 1) -100 ميكرولتر / بئر.
7. أغلق ألواح ELISA بغلاف بلاستيكي واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
8. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر IgG-HRP (انظر جدول المواد) مع PBST عند 1: 10,000.
9. اغسل اللوحة (ثلاث دورات ، كل دورة 300 ميكرولتر). ثم أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
10. تلطيخ وإنهاء: اغسل الطبق (خمس دورات ، كل دورة 300 ميكرولتر). أضف محلول تلطيخ 3،3 ′ ، 5،5 ′-tetramethylbenzidine (TMB) (100 ميكرولتر ؛ انظر جدول المواد) لكل بئر. ضع الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعيدا عن الضوء ، ثم قم بإنهاء التفاعل على الفور ب 50 ميكرولتر من 2 M H₂SO₄.
11. اكتشف قيمة الكثافة الضوئية (OD₄₅₀) بواسطة علامة إنزيم (اقرأ قيمة OD₄₅₀ في غضون 15 دقيقة بعد الإنهاء).

الجدول 1: تسلسل ELISA وقالب التخفيف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 5424-جهاز طرد مركزي صغير عالي السرعةFA-45-24-11 إيبندورف ، ألمانيا 5424000495 96 أطباق بئر كورنينج إنكوربوريتد ، الولايات المتحدة الأمريكية CLS3922 AFM Dimension FastScan BRUKER, ألمانيا صِفْر الفئران Balb / c بكين HFK Bioscience Co., Ltd. BCIP / NBT شركة فوتشو مايكسين لتطوير التكنولوجيا الحيوية ، الصين BCIP / NBT Bio-Rad 6.0 قارئ microplate شركة Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية صِفْر BL21 خلية مختصة ميرك ميليبور ، ألمانيا 70232-3CN بي إس إيه -100 جرام سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية ب 2064-100 جرام جهاز طرد مركزي 5810 R إيبندورف ، ألمانيا 5811000398 Coomassie حل تلطيخ أزرق فاتح G-250 MIKX ، الصين دبليو 236 حل إزالة اللون بوستر ، الصين AR0163-2 آلة التعشيب ذات درجة الحرارة الدائمة للتسخين الكهربائي HH-B11-420 مصنع شنغهاي Yuejin للأجهزة الطبية ، الصين صِفْر جهاز الرحلان الكهربائي مصنع بكين ليويي للأدوات ، الصين DYCZ-25D صورة جل تانون، الولايات المتحدة الأمريكية صِفْر راتنج الجلوتاثيون سيفاروز GST Mei5bio ، الصين راتنج كروماتوغرافيا التقارب H2SO4 تشنغدو كيشي الكيميائية المحدودة ، الصين 7664-93-9 بروتين مؤتلف HI الجامعة الطبية العسكرية الثالثة ، الصين 110-27-0 HRP - الماعز المضاد للفأر IgG بيودراجون ، الصين BF03001 HRP- الماعز المضاد للفأر IgG1 بيودراجون ، الصين BF03002R HRP- الماعز المضاد للفأر IgG2a بيودراجون ، الصين BF03003R HRP- الماعز المضاد للفأر IgG2b بيودراجون ، الصين BF03004R حلقة التلقيح Haimen Feiyue المحدودة ، الصين YR-JZH-1UL استنساخ IsdB و Hla شنغهاي جيريه التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، الصين صِفْر جوزة الطيب الأيزوبروبيل (مساعد دوائي ) SEPPIC, فرنسا صِفْر الأيزوبروبيل- β-D-1-mercaptogalactopyranoside fdbio ، الصين FD3278-1 مرقة LB مزرعة متوسطة بكين AOBOX التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، الصين 02-136 جهاز طرد مركزي مبرد بدرجة حرارة منخفضة إيبندورف ، ألمانيا صِفْر مالفيرن نانو ZS مالفيرن إنسترومنتس المحدودة ، المملكة المتحدة صِفْر غسالة ملابس مايكرو بليت 405 LSRS Bio Tek Instruments ، Inc هايلاند بارك ، الولايات المتحدة الأمريكية صِفْر أداة نقل الفيلم المدمجة Mini-TBC BeiJingDongFangRuiLi المحدودة ، الصين 1658030 MMC التعبئة توسو (شنغهاي) المحدودة هاتف: 22818 MRSA252 الولايات المتحدة الأمريكية ، ATCC صِفْر مقياس الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية Nanodrop ثيرمو ساينتفيك ، الولايات المتحدة الأمريكية صِفْر بروتين FlashTM الجديد أي KD PAGE طقم جل الرحلان الكهربائي للبروتين داكيوي، الصين 8012011 برنامج تلفزيوني بيوشارب ، الصين صِفْر تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مكبر للصوت Thermal Cycler ، الولايات المتحدة الأمريكية صِفْر البلازميد المؤتلف الجيني المستهدف pGEX شنغهاي جيريه التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، الصين B3528G حمض الفوسفوتونغستيك G-Clone, الصين CS1231-25g ماصه إيبندورف ، ألمانيا 3120000844 زيت الخروع متعدد الأكسجين (مساعد دوائي علاء الدين ، الصين K400327-1 كجم الجسم المضاد الأولي مختبر محلي الصنع:من الفئران المحصنة ذات الأمصال الإيجابية صِفْر انظر المرجع 11 للحصول على التفاصيل البروبيلين جلايكول (مساعد دوائي ) سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية P4347-500 مل علامة البروتين ثيرمو سيانتوفوك ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 26616 غشاء نقل PVDF Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية 88518 مسح المجهر الإلكتروني JEOL ، اليابان جي إس إم-IT800 تالوس L120C TEM ثيرمو فيشر ، الولايات المتحدة الأمريكية صِفْر حل ألوان TMB تيان جين ، الصين السلطة الفلسطينية107-01 مجموعات السلاحف شيامن Bioendo التكنولوجيا المحدودة ES80545 توين 20 ماكلين ، الصين 9005-64-5