تقييم الانقسام بوساطة كاسباز للبروتينات الفيروسية والمضيفة في الخلايا المصابة بالفيروس

الملخص

المصدر: Husain، M. تحديد الكاسباسات وزخارفها التي تشق البروتينات أثناء الإصابة بفيروس الأنفلونزا أ.J. Vis. Exp. (2022)

يوضح الفيديو طريقة لتقييم انقسام البروتين بوساطة كاسباز في الخلايا المصابة بالفيروس. عدوى ما بعد الفيروس ، يتم تنشيط الكاسباز وتتحلل البروتينات الخلوية المضيفة المختلفة والبروتينات النووية الفيروسية بينما تمنع مثبطات الكاسباز المحددة هذا التدهور ، كما أكدته النشاف الغربي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تقييم انقسام أو تدهور البروتينات في فيروس الأنفلونزا A ، الخلايا المصابة ب IAV بواسطة الكاسبيسات

1. البذور 3 × 10⁵ خلايا Madin-Darby (MDCK) أو A549 لكل بئر في لوحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئر. < / > ملاحظه: في حالة استخدام خلايا MDCK ، تأكد من أن الجسم المضاد ضد البروتين المعني يتعرف على أنواع.
2. قم بزرع الآبار في أزواج ، أي زوج تحكم - بئر واحد للعينة الوهمية غير المصابة والآخر للعينة المصابة الوهمية ، وزوج اختبار - بئر واحد للمثبطات غير المصابة عينة وواحد للمثبط المصاب عينة أ. زيادة عدد الأزواج مع كل مثبط إضافي.
3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت غلاف جوي 5٪ من ثاني أكسيد الكربون₂ بين عشية وضحاها.
4. في اليوم التالي ، قم بإصابة الخلايا ب IAV (نوع فرعي H1N1 أو نوع فرعي آخر).
   1. لهذا الغرض ، قم بإعداد لقاح الفيروس عن طريق تخفيف مخزون الفيروس في 400 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي الخالي من المصل (MEM) (انظر جدول المواد) بتعدد العدوى (MOI) من 0.5-3.0 وحدة تشكيل البلاك (pfu) / الخلية (عامل مضاعفة عدد الخلايا عند حساب وزارة الداخلية).
      ملاحظه: لإصابة خلايا MDCK ، استكمل لقاح الفيروس بتوسيل فينيل ألانيل كلورو ميثيل كيتون (TPCK) - تريبسين بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل.
5. قم بإزالة وسط الثقافة القديم من الخلايا (الخطوة 1.3) واغسل الخلايا ب 1 مل / بئر من MEM 2x الخالي من المصل.
6. أضف 400 ميكرولتر من لقاح الفيروس (الخطوة 1.4.1) إلى الخلايا واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 35 درجة مئوية تحت جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ (CO₂).
7. في غضون ذلك ، قم بتخفيف مثبط الكاسباز (على سبيل المثال ، Z-DEVD-FMK) ، أو مثبط الليزوزوم (على سبيل المثال ، كلوريد الأمونيوم ، NH₄Cl) ، أو مثبط البروتيازوم (على سبيل المثال ، MG132) (انظر جدول المواد) بتركيز نهائي يبلغ 40 ميكرومتر أو 20 ملي مولار أو 10 ميكرومتر ، على التوالي ، في MEM الخالي من المصل (انظر جدول المواد). يعمل المثبطان الأخيران كعنصر تحكم. قم بتخفيف حجم متساو من المذيب (إذا كان غير الماء) المستخدم لإعادة تكوين أحد المثبطات في وسط خال من المصل كوهمية.
8. قم بإزالة لقاح الفيروس وغسل الخلايا كما في الخطوة 1.5 (1x).
9. أضف MEM الخالي من المصل ، 1 مل / بئر ، وهمي أو مكمل بمثبط ، إلى الخلايا واحتضان الخلايا كما في الخطوة 1.6. تعتبر هذه النقطة الزمنية 0 ساعة العدوى.
10. بعد 24 ساعة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق كشطها باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل (جانب مطاطي) ونقلها إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 1.5 مل.
11. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 12,000 × جم لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اجمع المادة الطافية باستخدام ماصة.
    ملاحظه: يمكن التخلص من هذا المادة الطافية أو استخدامها في فحص البلاك لقياس عيار ذرية الفيروس الذي تم إطلاقه.
12. اغسل حبيبات الخلية ب 250 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق إعادة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.11.
13. قم بإزالة المادة الطافية وتحلل الخلايا عن طريق إضافة 80-100 ميكرولتر من محلول تحلل الخلية (50 ملي مولار تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان (THAM) هيدروكلوريد (Tris-HCl) ، درجة الحموضة 7.4 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 0.5٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم ، 1٪ تريتون X-100 ، و 1x كوكتيل مثبط البروتياز ، انظر جدول المواد) والدوامة.
14. قم بتسخين الأنبوب عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للتحلل تماما وتحضير محللة الخلية الكاملة. قم بتخزين المحللات عند 4 درجات مئوية لتنفيذ الخطوات 1.15-1.17 في اليوم التالي ، ولكن للحصول على أفضل النتائج ، قم بإنهاء هذه الخطوات في نفس اليوم.
15. قم بتقدير كمية البروتين في كل عينة باستخدام مجموعة مقايسة جدول حمض البيسنكونينيك (BCA) (انظر جدول المواد).
16. قم بحل كميات متساوية من البروتين من العينات غير المصابة والمصابة عن طريق الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد القياسي SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) جنبا إلى جنب مع علامات الوزن الجزيئي.
17. انقل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز أو ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) (انظر جدول المواد).
    ملاحظه: قد يعطي غشاء PVDF خلفية عالية في بعض أجهزة تصوير اللطخة الغربية. تحقق من التوافق.
18. قم بإجراء النشاف الغربي للكشف عن البروتين محل الاهتمام باستخدام الطريقة الموضحة في مكان آخر.
19. قارن مستويات البروتين في ممرات العينة المصابة المعالجة بالوهمية والمعالجة بالمثبطات.
    ملاحظه: إذا تعافى مستوى البروتين في ممر العينة المصاب المعالج بمثبطات الكاسباز ، فإن البروتين ينشق أو يتحلل بواسطة الكاسباس. خلاف ذلك ، يتم تحلله إما عن طريق الليزوزوم أو البروتيازوم.
20. قم بتحديد كمية استرداد البروتين عن طريق قياس شدة النطاق في كل حارة من ثلاث نسخ مكررة على الأقل من نفس التجربة وتطبيعها مع نطاق التحكم في التحميل المقابل.
21. استخدم أي تصوير معاصر والبرامج المرتبطة به (انظر جدول المواد) لتصوير البقع الغربية وتحديد استعادة البروتين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خلايا A549 ATCC CRM-CCL-185 الإنسان ، الظهارة ، الرئة كلوريد الأمونيوم سيجما ألدريتش أ 9434 مثبط كاسباز 3 سيجما ألدريتش هاتف 264156-م يعرف أيضا باسم "InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem" كوكتيل كامل صغير مثبط البروتياز روش 11836153001 الماعز المضاد للجسم المضاد ل NP هدية من ريتشارد ويبي (مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال ، ممفيس ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى MH خلايا MDCK ATCC CCL-34 ، الظهارة ، الكلى إم جي 132 سيجما ألدريتش M7449 الحد الأدنى من الوسيط الأساسي (MEM) ثيرموفيشر العلمي 11095080 أضف L-glutamine أو المضادات الحيوية أو المكملات الغذائية الأخرى حسب الحاجة تصوير Odyssey Fc مع برنامج Image Studio Lite 5.2 ليكور تم استبدال Odyssey Fc ب Odyssey XF وتم استبدال برنامج Image Studio Lite ببرنامج Empiria Studio. بيرس BCA مجموعة فحص البروتين ثيرموفيشر العلمي هاتف: 23225 غشاء النيتروسليلوز البروتران بريميوم سيتيفا (فومرلي جنرال إلكتريك للرعاية الصحية) 10600003 الأرانب المضادة للأجسام المضادة للأكتين أبكام أب8227 الأرانب المضادة للكورتاكتين إشارات الخلية 3502 ريال SeeBlue معيار البروتين الملون مسبقا ثيرموفيشر العلمي ال سي 5625 تريس حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم ، SDS ، ديوكسي كولات الصوديوم ، تريتون X-100 ميرك التربسين ، معالج ب TPCK سيجما ألدريتش 4370285