اختبار لقياس تراكم مسبار مضاد حيوي فلوري في الخلايا البكتيرية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Stone، M. R. L. ، et al. تصور المقاومة البكتيرية باستخدام مجسات المضادات الحيوية الفلورية. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو اختبارا لقياس تراكم مسبار مضاد حيوي فلوري في الخلايا البكتيرية. يؤدي التعرض لمثبط مضخة التدفق إلى تعطيل تدرج البروتون عبر الغشاء في الخلايا البكتيرية ، والذي يضاف عليه مضاد حيوي مترافق بالفلوروفور. يؤدي تثبيط مضخات التدفق بسبب تدرج البروتون المتقطع إلى تراكم المضاد الحيوي داخل البكتيريا. يتم تحلل الخلايا البكتيرية ، ويتم قياس شدة التألق لتأكيد تراكم المضادات الحيوية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تقييم النشاط المضاد للميكروبات

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الأعمال التي تنطوي على بكتيريا في ظروف معقمة لتجنب تلوث المقايسة أو المختبر. يجب تعقيم جميع الوسائط قبل الاستخدام ، ويجب أن تظل الأواني البلاستيكية والمعدات مثل الماصات معقمة. يوصى بالعمل في غطاء الاحتواء الحيوي (النوع 2).

1. مخزون الجلسرين المخطط من السلالات البكتيرية المناسبة لسقالة المضادات الحيوية على أجار مرق الليسوجيني (LB ، محضر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) ، وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية < برميل / > ملاحظه: يجب أن يتم اختيار البكتيريا لاختبار النشاط المضاد للبكتيريا بناء على سقالة المضادات الحيوية المستخدمة. يجب اختيار مجموعة تمثيلية من 5-10 بكتيريا من الأنواع المعروفة بأنها عرضة للمضاد الحيوي ، مع مراعاة القدرات اللوجستية للمختبر. إذا أمكن ، يجب أيضا اختبار البكتيريا المقاومة. سيعمل البروتوكول الوارد أدناه على معظم البكتيريا ، ولكن تحقق مما إذا كانت هناك حاجة إلى شروط خاصة (على سبيل المثال ،_ثاني أكسيد الكربون 2 ، وسائط خاصة) وقم بإجراء التعديلات حسب الضرورة. تشمل البكتيريا التي تم فحصها بنجاح باستخدام هذه الظروف المكورات العنقودية ، والمكورات العقدية ، والعصيات ، والإشريكية القولونية ، والكلسيلة الرئوية ، والزائفة الزنجارية ، والمكورات المعوية البرازية.
2. اختر مستعمرة واحدة من اللوحة ، واستزرعها طوال الليل في 5 مل من مرق مولر هينتون المعدل بالكاتيون (CAMHB ، معد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) عند 37 درجة مئوية.
3. خفف الثقافات الليلية ~ 40 ضعفا في CAMHB وتنمو إلى مرحلة منتصف السجل ، الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) = 0.4-0.8 ، الحجم 5 مل).
4. قم بإعداد محاليل مخزون لكل مضاد حيوي فلوري عند 1.28 مجم / مل في ماء معقم ، وماصة 10 ميكرولتر من المضاد الحيوي إلى العمود الأول من صفيحة 96 بئر.
5. أضف 90 ميكرولتر من CAMHB إلى العمود الأول و 50 ميكرولتر إلى جميع الآبار الأخرى. ثم قم بإجراء التخفيف التسلسلي 2 أضعاف عبر اللوحة.
6. امزج جيدا ، ثم خفف مزارع المرحلة المتوسطة إلى ~ 10⁶ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / مل وأضف 50 ميكرولتر إلى جميع الآبار ، لتوفير تركيز نهائي ~ 5 × 10⁵ CFU / mL.
   حجم المزرعة (مل) = (حجم الوسائط بالمل)/(OD₆₀₀ × 1,000)
   على سبيل المثال، بالنسبة لثقافة OD₆₀₀ = 0.5 في حجم وسائط مرغوب فيه يبلغ 12 مل، أضف (12/(0.5 × 1,000) = 0.024 مل من المزرعة إلى 12 مل من الوسائط
7. غطي الأطباق بأغطية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة دون اهتزاز.
8. افحص اللوحات بصريا ، مع كون الميكروفون هو أقل تركيز بئر بدون نمو مرئي.
   ملاحظه: انظر الجدول 1 للحصول على بعض الأمثلة على المضادات الحيوية الفلورية النشطة وغير النشطة.

فئة

2. تحليل تراكم المسبار بواسطة قياس الطيف

الضوئي

ملاحظة: تم تحسين أوقات الطرد المركزي هذه للإشريكية القولونية ، لذلك قد تكون هناك حاجة إلى تغييرات طفيفة للأنواع الأخرى. تم الإبلاغ عن البيانات التمثيلية لتراكم المسبار لمسبار سيبروفلوكساسين المسمى NBD.

مخزون
1. الجلسرين المخطط من السلالات البكتيرية على LB أجار وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
2. اختر مستعمرة واحدة من الطبق واستزراعها طوال الليل في LB عند 37 درجة مئوية.
3. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها ~ 50 ضعفا في الوسائط وتنمو إلى مرحلة منتصف السجل (OD₆₀₀ = 0.4-0.8).
4. الطرد المركزي الثقافات عند 1,470 × جم لمدة 25 دقيقة وصب الوسائط.
5. أعد تعليق البكتيريا في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 1,470 × جم لمدة 15 دقيقة.
6. صب الوسائط وإعادة تعليق الكريات المغسولة في PBS إلى OD_{نهائي 600} = 2.
7. إذا رغبت في ذلك ، أضف 10.1 ميكرولتر من سيانيد الكربونيل 3-كلوروفينيل هيدرازون (CCCP ، 10 ملي مولار في PBS) إلى 1 مل من البكتيريا (التركيز النهائي 100 ميكرومتر) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق < br / > ملاحظه: CCCP هو مثبط لمضخة التدفق. وستسمح إضافة CCCP بفحص تأثير التدفق.
8. الطرد المركزي الثقافات عند 18,000 × جم لمدة 4 دقائق عند 20 درجة مئوية وصب الوسائط.
9. أضف 1 مل من محلول المضادات الحيوية الفلورية (10-100 ميكرومتر في PBS) إلى الحبيبات ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
10. الطرد المركزي الثقافات عند 18,000 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية وصب الوسائط.
11. أعد تعليق البكتيريا في 1 مل من PBS البارد ، وكرر الخطوة 2.9.
12. كرر الخطوة 2.10 بإجمالي 4x.
13. إذا رغبت في ذلك ، قم بتحلل البكتيريا عن طريق إضافة 180 ميكرولتر من محلول التحلل (20 ملي Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 2 ملي صوديوم EDTA) ثم 70 ميكرولتر من الليزوزيم (72 مجم / مل في H₂O).
14. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بالتجميد والذوبان 3 مرات (-78 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم 34 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة).
15. قم بتسخين العينات لمدة 20 دقيقة ، ثم سخنها إلى 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
16. جهاز الطرد المركزي للعينات المحللة (18,000 × جم ، 8 دقائق) ، ثم قم بالتصفية من خلال غشاء مرشح 10 كيلو دالتون.
17. اغسل الفلتر 4x ب 100 ميكرولتر من الماء.
18. انقل المحللة إلى صفيحة بئر سوداء مسطحة القاع 96 وقم بقياس شدة التألق على قارئ لوحة بأطوال موجية للإثارة والانبعاث المناسبة للفلوروفور (على سبيل المثال ، 7- (ثنائي ميثيل أمينو) -2-oxo-2H-chromen-4-yl [DMACA]: λ_ex = 400 نانومتر ، λ_em = 490 نانومتر ؛ nitrobenzoxadiazole [NBD]: λ_ex = 475 نانومتر ، λ_em = 545 نانومتر).
    ملاحظه: انظر الشكل 1 للحصول على أمثلة على التحليلات الطيفية للبكتيريا باستخدام مضاد حيوي سيبروفلوكساسين الفلوري المسمى NBD.

النتائج

p class = "jove_content" > الجدول 1. أنشطة المضادات الحيوية لمجسات المضادات الحيوية الفلورية القائمة على سيبروفلوكساسين وتريميثوبريم ولينزوليد ضد السلالات البكتيرية المناسبة سريريا ذات الصلة ، كما تم قياسها بواسطة فحوصات MIC للتخفيف الدقيق للمرق. في معظم الحالات ، فقدت المجسات بعض النشاط مقارنة بالدواء الأصلي ، لكنها احتفظت ببعض فعالية المضادات الحيوية القابلة للقياس (كافية لتكون مفيدة في مزيد من الدراسات).

< td colspa...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات وحدة مرشح الطرد المركزي Amicon Ultra-0.5 مع غشاء Ultracel- 10 ميرك UFC501096 مطياف بروكر أفانس 600 ميجاهرتز بروكر CCCP سيجما ألدريتش سي 2759 كليت 545 سيجما ألدريتش 22140-5 كجم-فهرنهايت سيجل أبكام أب109204 FM4-64FX ، تناظرية قابلة للإصلاح من صبغة غشاء FM™ 4-64 تقنيات الحياة أستراليا بي تي F34653 جاما 2-16 LSCplus lyophilise المسيح هاتيش Zentrifugen Rotofix 32 هيتيتش رطل أمريسكو J106 الليزوزيم من بياض بيض الدجاج
مسحوق مجفف بالتجميد سيجما ألدريتش L6876 مولر هينتون الثاني مرق كاتيون تعديل بيكتون ديكنسون 212322 سيجما 1-15 أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سيجما ألدريتش تيكان إنفينيت M1000 برو تيكان