عزل الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة من نموذج الفأر

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Meng ، M. ، et al. العلاج المناعي بالتبني لخلايا iNKT في فئران RA المستحثة بالجلوكوز -6 فوسفات (G6PI).J. Vis. Exp.(2020)

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة ، والمعروفة أيضا باسم خلايا iNKT. يبدأ الإجراء بحقن جليكوليبيد اصطناعي في الفأر لتحفيز تنشيط وتكاثر خلايا iNKT في الطحال. بعد ذلك ، يتم تحضير معلقات أحادية الخلية من الطحال وتحضنها بمجمعات التعرف على خلايا iNKT المسمى بالفلوروفورات ، متبوعة بالفصل القائم على الخرزة المغناطيسية ، لعزل خلايا iNKT.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. الحصول على الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة (خلايا iNKT) مع العلاج الخلوي بالتبني

1. الحث الاتجاهي لخلايا iNKT
   1. حقن الفئران العادية داخل الصفاق مع α-Galactosylceramide (α-GalCer) (0.1 مجم / كجم من وزن الجسم).
2. عزل خلايا iNKT
   1. بعد ثلاثة أيام من النمذجة ، قم بحقن الفئران داخل الصفاق بنسبة 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (50 مجم / كجم من وزن الجسم) للتخدير. لا تظهر الفئران المخدرة بشكل كاف استجابة انسحاب مخلب خلفي لقرصة إصبع القدم.
   2. عزل طحال فأر DBA / 1 بعد حقنه داخل الصفاق باستخدام α-GalCer. قم بإعداد تعليق أحادي الخلية عن طريق قطع الطحال وطحنه في منخل 200 شبكة.
   3. اغسل معلق الخلية بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. كرر.
   4. أعد تعليق الخلايا ب 1 مل من محلول تخفيف الدم والأنسجة الكاملة. أضف 3 مل من وسط فصل الخلايا الليمفاوية للفئران ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 20 دقيقة عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة.
   5. اجمع طبقة الخلايا الليمفاوية البيضاء اللبنية (أي الطبقة الثانية من الأعلى) ، واغسلها 2x باستخدام PBS ، واعدها بعداد الخلايا الآلي.
3. استراتيجية الاختيار الإيجابية لفرز الخلايا المنشطة المغناطيسية (MACS) لتنقية خلايا iNKT
   ملاحظه: بالنسبة للمعالجة المسبقة للرباعيات CD1d ، تم تخفيف 1 مجم / مل من α-Galcer إلى 200 ميكروغرام / مل مع 0.5٪ من Tween-20 و 0.9٪ من كلوريد الصوديوم ، وأضيف 5 ميكرولتر من المحلول الناتج إلى 100 ميكرولتر من محلول ترتامر CD1d. تم تحضين الخليط لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة ووضعه عند 4 درجات مئوية للاستخدام. تم تخفيف β مستقبلات الخلايا التائية (TCR) 80 مرة بالماء منزوع الأيونات. تم استخدام جميع الأجسام المضادة الأخرى كمحلول مخزون.
   1. أعد تعليق 10⁷ خلايا مع 100 ميكرولتر من 4 درجات مئوية PBS ، وأضف 10 ميكرولتر من CD1d Tetramer-phycoerythrin المحمل ب α-GalCer (CD1d Tetramer-PE) ، واحتضنها عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
   2. اغسل الخلايا 2x باستخدام PBS وأعد تعليقها في 80 ميكرولتر من PBS.
   3. أضف 20 ميكرولتر من الخبيبات الدقيقة المضادة ل PE واحتضنها عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.
   4. اغسلها 2x باستخدام PBS وأعد تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS.
   5. ضع عمود الفرز في المجال المغناطيسي لفارز MACS واشطفه ب 500 ميكرولتر من PBS.
   6. أضف تعليق الخلية من الخطوة 1.3.4 إلى عمود الفرز ، واجمع التدفق ، واشطف 3x باستخدام المخزن المؤقت PBS.
   7. قم بإزالة المجال المغناطيسي وجمع الخلايا من عمود الفرز. في هذه المرحلة ، أضف 1 مل من المخزن المؤقت PBS إلى عمود الفرز وادفع المكبس بسرعة عند ضغط ثابت لدفع الخلايا المسماة إلى أنبوب التجميع والحصول على خلايا iNKT المنقاة. عد باستخدام عداد خلوي آلي.

المواد