مقالة منهجية

تعزيز التنبيغ الفيروسي في الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام بوليمر كاتيوني

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Nanbakhsh، A.، et al. Dextran يعزز كفاءة نقل الفيروسات للفئران والخلايا القاتلة الطبيعية الأولية البشرية. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو فحصا للنقل الفيروسي بوساطة البوليمر الكاتيوني في الخلايا القاتلة الطبيعية (NK). يتم تحضين الخلايا بنواقل الفيروس العدسي المعدلة وراثيا التي تشفر بروتين الفلورسنت. تمكن إضافة البوليمر الكاتيوني الفيروس من الالتصاق بالخلايا ودمج الحمض النووي الريبي الخاص به في جينوم المضيف ، معبرا عن البروتين الفلوري. يتم قياس التألق كميا لتقييم التعزيز الناجم عن البوليمر للتحويل.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. نقل الفئران والخلايا القاتلة الطبيعية الأولية البشرية مع فيروس العدسات

  1. قم بتعليق الخلايا القاتلة الطبيعية للفأر أو الخلايا الطبيعية الأولية البشرية في صفيحة مكونة من 24 بئرا عند 0.5 × 105 / مل من الوسط في وجود طافي فيروس العدسات بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) عند تعدد العدوى 5 و 10 و 20 (MOI) وفي وجود الرصاص (8 ميكروغرام / مل) أو PS (8 ميكروغرام / مل) أو ديكستران (8 ميكروغرام / مل).
  2. الطرد المركزي للألواح عند 1,000 × جم لمدة 60 دقيقة.
  3. بدون صب المادة الطافية ، قم بزراعة الخلايا بين عشية وضحاها (16-18 ساعة) في حاضنة 37 درجة مئوية مملوءة ب 5.2٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  4. يغسل ب 10 مل من PBS ويعلق في 2 مل من وسط استزراع معهد روزويل بارك التذكاري الكامل (RPMI) 1640 في وجود إنترلوكين 2 (IL-2 ، 300 وحدة / مل).
  5. احصد الخلايا القاتلة الطبيعية المنقولة في اليوم 7 عن طريق النقر برفق على القوارير.
    1. تنشيط الخلايا المحصودة بتركيزات معايرة من المجموعة القاتلة الطبيعية المضادة للطبيعة 2D (NKG2D) (A10) مللي أمبير عن طريق طلاء ألواح البوليسترين عالية الامتصاص 96 بئرا بتركيزات 2.5 ميكروغرام / مل من ملي أمبير مضاد للمضادات NKG2D بين عشية وضحاها.
    2. اغسل كل بئر ب 100 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثلاث مرات قبل إضافة الخلايا القاتلة الطبيعية الأولية.
  6. اجمع المواد الطافية المزرعة باستخدام ماصة متعددة القنوات بين 16 و18 ساعة بعد التنشيط لتحديد كمية السيتوكينات مثل الإنترفيرون جاما (IFN-γ). قم بإنشاء منحنيات قياسية باستخدام السيتوكينات المؤتلفة المزودة بمجموعات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
  7. اختبر صلاحية الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام تلطيخ annexin-V / 7-amino-actinomycin D (7-AAD) وحدد النسبة المئوية للخلايا الميتة بين الخلايا القاتلة الطبيعية المحولة باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
    1. لإجراء هذا الفحص ، قم بحصاد الفئران والخلايا القاتلة الطبيعية البشرية بعد أربعة أيام من التنبيغ ، واغسلها مرتين ب 10 مل من PBS البارد عند 500 × جم لمدة 5 دقائق لكل منهما ، واحتضانها باستخدام مجموعة Annexin-V (PE) / 7-AAD.
  8. استخدم برنامج قياس التدفق الخلوي المناسب لتحليل البيانات. حدد مجموعة الخلايا الحية وحلل التعبير عن GFP (قناة فلوريسين إيزوثيوسيانات [FITC]) كمقياس لنقل الفيروس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ديكستران سيجما ألدريتش 90-64-91-9 بوليبرين (Pb) سيجما ألدريتش تي آر -1003 كبريتات البروتامين (PS) سيجما ألدريتش ص 3369 RPMI1640 كورنينج 10-040-السيرة الذاتية إنترفيرون جاما (IFN-γ ) العلوم البيولوجية الإلكترونية 14-7311-85 محلول تلطيخ بروبيديوم لوديد دينار بحريني 51-66211ه ليبوفيكتامين 3000 ثيرمو فيشر L3000015 إيزوفلوران فينكس NDC 57319-559-05 293 خلايا T ATCC CRL-3216 قوارير T75 كورنينج 430641 وحدة مجموعات ELISA العلوم الأحيائية 00-4201-56

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

2

مقالات ذات صلة