مقالة منهجية

نقل البلاعم الأولية باستخدام mRNA المعدل

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Herb ، M. et al. ، تعداء عالي الكفاءة للبلاعم الأولية باستخدام mRNA المنسوخ في المختبر. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو عملية نقل البلاعم الأولية باستخدام mRNA المعدل الذي يشفر بروتين الفلورسنت الأخضر. تضمن هذه الرنا المرسال المعدلة ، المصممة لتقليل المناعة وتحسين استقرارها ، التعداء الناجح والتعبير اللاحق عن بروتينات الفلورسنت الخضراء ، والتي يتم تأكيدها من خلال الفحص المجهري الفلوري.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات مرتديا القفازات. قم بتنفيذ جميع خطوات التعدي تحت غطاء التدفق الصفحي لمنع تلوث الخلايا. قبل العمل باستخدام mRNA، قم بتنظيف جميع الأدوات مثل الماصات وكل سطح بنسبة 70٪ من الإيثانول و / أو مادة خافضة للتوتر السطحي تحلل RNAse (جدول المواد). تأكد من أن جميع أنابيب التفاعل خالية من الحمض النووي الريبي ومعقمة. استخدم فقط الماء المعقم الخالي من الحمض النووي الريبي للتخفيفات. استخدم أطراف الماصة حصريا مع المرشحات. قم بتغيير أطراف الماصة بعد كل خطوة سحب العينة.

< p class = "jove_title" >1. إنشاء قالب الحمض النووي

ملاحظة: يجب أن يحتوي قالب الحمض النووي لنسخ mRNA في المختبر باستخدام هذا البروتوكول على تسلسل T7 promotor للسماح بإرساء بوليميراز الحمض النووي الريبي. إذا كان البلازميد الذي يحتوي على تسلسل الحمض النووي للبروتين محل الاهتمام يحتوي بالفعل على تسلسل T7 المحفز الموجه بشكل صحيح مباشرة في اتجاه المنبع من تسلسل الاهتمام ، فيجب إجراء خطية البلازميد (انظر الخطوة 1.1). خلاف ذلك ، قم بإرفاق محرك T7 بتسلسل الاهتمام عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (تفاعل البوليميراز المتسلسل ، انظر الخطوة 1.2.).

  1. خطية البلازميدات المحتوية على محرك T7
    1. بلازميدات خطية تحتوي بالفعل على تسلسل T7 promotor موجه بشكل صحيح عن طريق الهضم مع إنزيم تقييد يقطع في اتجاه مجرى كودون التوقف لتسلسل الاهتمام. خلاف ذلك ، لن ينتهي النسخ بشكل صحيح بعد تسلسل الاهتمام.
      ملاحظة: من الأفضل استخدام إنزيمات التقييد التي تترك نهايات حادة أو 5 بوصات متدلية.
    2. تأكيد الخطية الكاملة للبلازميد عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز للحمض النووي البلازميد غير المهضوم مقابل المهضوم.
    3. قم بتنقية الحمض النووي البلازميد الخطي قبل استخدامه كقالب للحمض النووي لنسخ الحمض النووي المرسال في المختبر باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي (جدول المواد).
  2. إرفاق محرك T7 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل
    1. استخدم برايمر أمامي يحتوي على المكونات التالية (بالترتيب المشار إليه من 5 إلى 3 '): حوالي 5 نقاط أساس عشوائية في المنبع من المحفز (على سبيل المثال ، GAAAT) ؛ التسلسل الحركي T7 (TAATACGACTCACTATAG) ؛ اثنان إضافيان من Gs لزيادة كفاءة النسخ (GG) ؛ الجزء الخاص بالتسلسل المستهدف المتماثل مع تسلسل البلازميد المحيط بكودون البداية.
      ملاحظه: يجب أن يتكون من 3-6 نقطة أساس في اتجاه المنبع من تسلسل KOZAK وكودون البداية ، وتسلسل KOZAK وكودون البداية (عادة GCCACC ATG G) ، 12-18 نقطة أساس في اتجاه مجرى كودون البداية. إذا كان تسلسل الاهتمام لا يحتوي بالفعل على تسلسل KOZAK أو كودون بدء ، فيمكن إرفاقها في هذه الخطوة ببساطة عن طريق تضمينها في التسلسل التمهيدي.
    2. احسب tm من التمهيدي الأمامي فقط من خلال مراعاة الجزء المتماثل للتسلسل المستهدف.
    3. لتقييم تكوين ثنائيات / دبوس الشعر ، استخدم التسلسل التمهيدي بالكامل ، والذي يمكن أن يتجاوز بسهولة 50 نقطة أساس.
    4. استخدم برايمر عكسي يقع في مكان ما في اتجاه مجرى كودون التوقف.
      ملاحظة: إذا كان تسلسل الاهتمام لا يحتوي بالفعل على كودون توقف ، فيمكن إرفاقه في هذه الخطوة ببساطة عن طريق تضمينه في تسلسل التمهيدي.
    5. استخدم الاشعال الأمامية والخلفية لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميراز عالي الدقة مع التدقيق اللغوي (جدول المواد).
    6. تأكد من توليد منتج واحد وحجم أمبليكون عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز (على سبيل المثال ، استخدم هلام الاغاروز 1٪ وتيار ثابت 100 فولت).
    7. قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل استخدامه كقالب من الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) لنسخ الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) في المختبر باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي.
فئة

2. توليد mRNA

  1. قم بإذابة جميع مكونات مجموعة نسخ mRNA في المختبر (انظر جدول المواد). دوامة لمدة 5 ثوان وتدور لأسفل لمدة ثانية عند 2,000 × جم. يحفظ على الثلج حتى الاستخدام.
  2. قم بإعداد مزيج التفاعل لنسخ mRNA في المختبر في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل بالترتيب التالي (الحجم الإجمالي 40 ميكرولتر): 20 ميكرولتر من 10x نظائر الغطاء العكسي / مزيج ثلاثي فوسفات النيوكليوزيد (ARCA / NTP) (المدرج في مجموعة نسخ mRNA في المختبر) ؛ 0.25 ميكرولتر من 5-ميثيل سيتيدين ثلاثي الفوسفات (5-mCTP) (التركيز النهائي (f.c.) هو 1.25 ملي مولار ؛ 50٪ من إجمالي CTP) ؛ 0.25 ميكرولتر من ثلاثي الفوسفات الزائف يوريدين (pseudo-UTP) (f.c. هو 1.25 المليمتر; 50٪ من إجمالي UTP) ؛ X ميكرولتر من قالب الحمض النووي ؛ 2 ميكرولتر من مزيج بوليميراز T7 RNA (مدرج في مجموعة نسخ mRNA في المختبر) ؛ Y ميكرولتر من H2O.
    خال من RNAse ملاحظة: X هو حجم يحتوي على 1 ميكروغرام على الأقل من الحمض النووي. على سبيل المثال ، 1.6 ميكرولتر من محلول مخزون 625 نانوغرام / ميكرولتر. Y هو الحجم الاحتياطية للحجم الإجمالي البالغ 40 ميكرولتر.
  3. دوامة لمدة 5 ثوان وتدور لأسفل لمدة ثانية عند 2,000 × جم. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 400 دورة في الدقيقة على خلاط حراري للنسخ في المختبر.
  4. ثم أضف 2 ميكرولتر من DNase I مباشرة إلى مزيج التفاعل لإزالة الحمض النووي للقالب. دوامة لمدة 5 ثوان وتدور لأسفل لمدة ثانية عند 2,000 × جم.
  5. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند 400 دورة في الدقيقة على الخلاط الحراري. خذ كمية من 2 ميكرولتر لجل التحكم (الخطوة 3.3) وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  6. بالنسبة لمخلفات بولي (أ) ، أضف المكونات التالية مباشرة إلى مزيج التفاعل السابق (إلى الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولتر): 5 ميكرولتر من 10x بولي (A) محلول تفاعل البوليميراز و 5 ميكرولتر من بولي (A) بوليميراز (كلاهما مدرج في مجموعة نسخ mRNA في المختبر). دوامة لمدة 5 ثوان وتدور لأسفل لمدة ثانية عند 2,000 × جم.
  7. احتضن المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 400 دورة في الدقيقة على خلاط حراري. خذ كمية من 2 ميكرولتر لجل التحكم (الخطوة 3.3) وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  8. لإزالة الفسفرة من نهايات 5 'من mRNA ، أضف المكونات التالية مباشرة إلى مزيج التفاعل السابق (إلى الحجم النهائي البالغ 60 ميكرولتر): 3 ميكرولتر من H2O الخالي من RNAse ؛ 6 ميكرولتر من 10x عازلة تفاعل الفوسفاتيز في القطب الجنوبي ؛ 3 ميكرولتر من فوسفاتيز القطب الجنوبي (15 وحدة لحجم تفاعل 60 ميكرولتر). دوامة لمدة 5 ثوان وتدور لأسفل لمدة ثانية عند 2,000 × جم.
  9. احتضان المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 400 دورة في الدقيقة على الخلاط الحراري.
  10. تعطيل الحرارة الفوسفاتيز في القطب الجنوبي عن طريق الحضانة عند 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
    ملاحظه: من الناحية المثالية ، استخدم خلاطا حراريا منفصلا ، ولا تنتظر حتى يصل الخلاط الأول إلى درجة الحرارة المطلوبة.
< p class = "jove_title" >3. تنقية mRNA

  1. قم بتنقية mRNA المنسوخ في المختبر باستخدام مجموعة مخصصة لتنقية الحمض النووي الريبي (جدول المواد).
    1. أضف X ميكرولتر من محلول الشطف إلى مزيج تفاعل الرنا المرسال من الخطوة 2.10. امزج عن طريق التقليب 5 مرات. أضف 300 ميكرولتر من تركيز محلول الربط. امزج عن طريق سحب العينة اللطيف 5 مرات.
      ملاحظة: X هو الحجم الاحتياطي للحجم الإجمالي البالغ 100 ميكرولتر. على سبيل المثال ، أضف محلول شطف 40 ميكرولتر إلى مزيج تفاعل 60 ميكرولتر من mRNA.
    2. أضف 100 ميكرولتر من الإيثانول الخالي من الحمض النووي الريبي. تخلط عن طريق سحب العينة اللطيف 5 مرات.
    3. ضع عمود مرشح في أحد أنابيب التجميع المرفقة. انقل مزيج تفاعل الرنا المرسال برفق إلى وسط المرشح دون لمس الفلتر. جهاز طرد مركزي عند 15,000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. ارفع عمود المرشح بعناية وتخلص من التدفق في أنبوب التجميع. ضع عمود المرشح مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع.
    5. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل (لا تنس إضافة 20 مل من الإيثانول الخالي من RNAase قبل استخدام محلول الغسيل لأول مرة).
    6. جهاز طرد مركزي عند 15,000 × جم لمدة دقيقة واحدة في RT. كرر الخطوات 3.1.4-3.1.6 للغسيل مرة أخرى.
    7. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة (17,900 × جم) لمدة دقيقة واحدة عند RT لإزالة أي سائل متبقي من عمود المرشح. خذ عمود المرشح بعناية من أنبوب التجميع. ضع عمود المرشح في أنبوب تجميع جديد.
    8. أضف 50 ميكرولتر من مخزن الشطف المؤقت إلى وسط الفلتر دون لمس الفلتر. احتضن عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الخلاط الحراري.
    9. جهاز طرد مركزي عند 15,000 × جم لمدة 1 دقيقة في RT. قم بإزالة عمود المرشح وتخلص منه.
  2. قم بقياس تركيز ونقاء الرنا المرسال المرسل ، على سبيل المثال ، باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم لقياس الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر><. ملاحظة: تشير نسبة A260 / A280 من 1.8-2.1 إلى mRNA عالي النقاء.
  3. تحقق من وجود منتج واحد ، وطول النسخة الصحيحة ، ومخلف بولي (A) من خلال تحليل الحصص من الخطوتين 2.5 و 2.7 بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز في ظل ظروف تغيير الطبيعة (على سبيل المثال ، استخدم هلام الاغاروز بنسبة 1.2٪ الذي يحتوي على 20 ملي مولار 3- (N-morpholino) حمض البروبان سلفونيك [MOPS] ، و 5 ملي أسيتات الصوديوم ، و 1 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) و 20٪ فورمالديهايد وتشغيله في 20 ملي مولار ، 5 ملي مولار أسيتات الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA و 0.74٪ فورمالديهايد عند تيار ثابت 100 فولت).
  4. قم بتخزين mRNA المنقى في أنبوب الشطف عند -80 درجة مئوية حتى التعداد. إذا كنت تستخدم كميات منخفضة فقط من mRNA للتعداء ، فقم بنقل mRNA لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. < / > ملاحظة: يمكن تخزين mRNA عند -80 درجة مئوية لمدة عام تقريبا.
< p class = "jove_title" >4. تحضير البلاعم

  1. القتل الرحيم للفئران C57 / BL6 (استخدم الفئران من نفس الجنس وعمر 6-24 أسبوعا) عن طريق خلع عنق الرحم.
    ملاحظة: يمكن استخدام نفس الفئران لعزل البلاعم الأولية (PM) (الخطوة 4.2) وتوليد BMDM (الخطوتان 4.3 و 4.4). لعزل الجمياز الجسيمي ، استخدم فأرين على الأقل. إن فقط [بمدم] كنت كنت تولدت فأرة واحدة عادة كافية.
  2. التخصيب المناعي المغناطيسي للضامة الصفاقية.
    1. املأ حقنة سعة 10 مل بقنية 0.9 × 40 مم ب 8 مل من محلول ملحي مخزمن بالفوسفات المثلج (PBS) و 2 مل من الهواء. اغسل التجويف البريتوني باستخدام PBS. سيشكل الهواء فقاعة تقلل من تسرب PBS.
    2. اجمع الغسيل البريتوني بسرعة بنفس المحقنة وانقله إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل. اجمع بين الخلايا البريتونية لعدة فئران إذا لزم الأمر. حافظ على تعليق الخلية على الجليد.
    3. تعليق خلية الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من 0.2٪ كلوريد الصوديوم لمدة 30 ثانية لتحلل خلايا الدم الحمراء.
    4. أضف 5 مل من 1.6٪ كلوريد الصوديوم إلى الحجم الإجمالي البالغ 10 مل لإعادة تكوين الظروف متساوية التوتر. جهاز طرد مركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 97.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية (MCS) (2 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك [EDTA] ، 0.5٪ ألبومين مصل البقر [BSA] في PBS) لكل 1 غسل بريتوني (على سبيل المثال ، إذا تم مسح ثلاثة فئران ، فقم بإعادة تعليقها في 292.5 ميكرولتر).
    6. أضف 2.5 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المترافقة مع جسم مضاد خاص ب CD11b لكل 97.5 ميكرولتر من تعليق الخلية (على سبيل المثال ، أضف 7.5 ميكرولتر إلى 292.5 ميكرولتر).
    7. احتضن على الجليد لمدة 15 دقيقة عند 150 دورة في الدقيقة على شاكر مداري.
    8. تعليق خلية الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت MCS.
    9. أضف 4 مل من المخزن المؤقت MCS إلى الحجم الإجمالي البالغ 5 مل واغسل الخلايا عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات.
    10. كرر الخطوتين 4.2.8 و 4.2.9 مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث خطوات غسيل.
    11. أثناء خطوات الغسيل ، ضع عمود LS في فاصل الخلايا المغناطيسية (انظر جدول المواد). اشطف العمود ب 3 مل من MCS buffer.
      ملاحظه: تجنب أي فقاعات لأنها قد تسد العمود.
    12. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت MCS. أضف 3 مل من المخزن المؤقت MCS إلى الحجم الإجمالي البالغ 4 مل ، واخلطه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث مرات.
    13. انقل 4 مل من تعليق الخلية إلى عمود LS المغسول.
      ملاحظة: مرة أخرى ، تجنب أي فقاعات لأنها قد تسد العمود.
    14. انتظر حتى يصبح خزان العمود فارغا تماما. لا تضيف سائلا إضافيا حتى يتوقف العمود عن التنقيط.
    15. أضف 3 مل من المخزن المؤقت MCS إلى العمود. ثم انتظر حتى يصبح خزان العمود فارغا تماما. كرر الخطوة 4.2.15 مرتين أخريين.
    16. ضع عمود LS في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. ضع 5 مل من المخزن المؤقت MCS على العمود. انتظر حتى يمر 2 مل من السائل عبر العمود ، ثم استخدم المكبس لدفع الجزء المتبقي برفق إلى الأنبوب.
    17. تعليق خلية الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    18. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) المكمل بمصل ربلة الساق الجنينية المعطلة بالحرارة بنسبة 10٪ (DMEM + FCS).
    19. حدد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق العد في محلول التريبان الأزرق في غرفة عد نيوباور وخلايا البذور في DMEM + FCS في لوحات الاستزراع.
      ملاحظة: البذور PM بكثافة 100,000 خلية / بئر في صفيحة ميكروتيتر مسطحة القاع. لا تستخدم الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة حيث لا يمكن فصل الجسيمات عن هذه الأطباق. استخدم الأطباق غير المعالجة بدلا من ذلك.
  3. توليد BMDM
    1. قم بإزالة الجلد والعضلات من الساقين الخلفيتين باستخدام مقص. اغسل كل ساق عن طريق الغمر القصير في 70٪ من الإيثانول.
    2. افصل الساقين وافتح طرفي عظم الفخذ والساق عن طريق القطع بالمقص.
    3. املأ حقنة سعة 5 مل مملوءة بقنية 0.6 مم × 30 مم ب 5 مل من السموم الداخلية المنخفضة جدا (VLE) RPMI 1640 وقم بإخراج نخاع العظم من العظام المفتوحة في طبق الاستزراع.
    4. اجمع بين نخاع عظم الفئران المتعددة إذا لزم الأمر بتكرار الخطوات 4.3.1-4.3.3. انقل نخاع العظم إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
      5. قم
    5. بالطرد المركزي لتعليق نخاع العظم عند 650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (8.3٪ كلوريد الأمونيوم ، NH4Cl ، 0.1 M Tris) واحتضن لمدة 5 دقائق في RT لتحلل خلايا الدم الحمراء.
      7. قم
    7. بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 650 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
    8. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 مكمل ب 10٪ FCS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين و 1٪ HEPES و 1٪ بيروفات الصوديوم و 10 نانوغرام / مل عامل تحفيز مستعمرة البلاعم المؤتلف (M-CSF) (RPMI+++++).
    9. أضف 4 مل من RPMI+++++ إلى الحجم الإجمالي 5 مل.
    10. قم بإعداد أطباق بتري غير المعالجة مقاس 5 92 مم × 16 مم مع كاميرات (انظر جدول المواد) لكل فأرة عن طريق سحب 7 مل من RPMI+++++ متوسط في كل طبق.
    11. انقل 1 مل من محلول الخلية إلى 5 أطباق محضرة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    12. بعد 4 أيام ، قم بإطعام الخلايا بإضافة 4 مل من RPMI+++++. بعد 6-7 أيام ، يتم تمييز خلايا نخاع العظم تماما إلى BMDM.
  4. حصاد BMDM
    1. قم بإزالة الوسيط تماما من أطباق الثقافة. أضف 5 مل من 0.2 ملي مولار EDTA الدافئ في PBS إلى كل طبق.
    2. اكشط اللوحة بأكملها برفق باستخدام مكشطة خلية لفصل BMDM. اجمع معلقات الخلية في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
    3. اغسل جميع الأطباق ال 5 مرة أخرى. استخدم نفس الحجم البالغ 5 مل من 0.2 ملي EDTA الدافئ في PBS لجميع الأطباق الخمسة. اجمع بين تعليق الخلية هذا مع تعليق الخطوة السابقة.
      4. قم
    4. بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط VLE RPMI 1640 مكمل ب 10٪ FCS و 1٪ HEPES و 1٪ بيروفات الصوديوم و 10 نانوغرام / مل M-CSF المؤتلف ولكن بدون مضادات حيوية (RPMI ++++).
    6. حدد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق العد في محلول التريبان الأزرق في غرفة عد نيوباور وخلايا البذور في RPMI ++++ في لوحات الاستزراع.
      ملاحظه: بذور BMDM بكثافة 50,000 خلية / بئر كحد أقصى في صفيحة ميكروتيتر مسطحة القاع. لا تستخدم الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة حيث يصعب فصل BMDM عنها. استخدم الأطباق غير المعالجة بدلا من ذلك.
< p class = "jove_title" >5. تعداء البلاعم باستخدام mRNA

  1. احسب الحجم المطلوب للمخزن المؤقت لتعداء الرنا المرسال. < / > ملاحظه: يعتمد حجم المخزن المؤقت لتعداء الرنا المرسال المطلوب على حجم البئر: استخدم 200 ميكرولتر للتعداء في صفيحة من 6 آبار ، و 100 ميكرولتر في صفيحة 12 بئرا ، وما إلى ذلك. أضف دائما القليل من الحجم الإضافي بسبب فقدان سحب العينات (ولكن ليس أكثر من اللازم، لمنع التخفيف غير المبرر للرنا المرسال). على سبيل المثال ، استخدم 450 ميكرولتر بدلا من 4 × 100 ميكرولتر = 400 ميكرولتر للنقل في 4 آبار من صفيحة 12 بئرا.
  2. احسب الحجم المطلوب من كاشف نقل الرنا المرسال. يضاف كاشف تعداء الرنا المرسال بنسبة 1:50. على سبيل المثال ، مطلوب 9 ميكرولتر من كاشف تعداء mRNA لحجم نهائي يبلغ 450 ميكرولتر.
  3. احسب الكمية الإجمالية للرنا المرسال المرسال المطلوبة. مطلوب ما لا يقل عن 100 نانوغرام لكل 100,000 ضامة من أجل التعداء الفعال ، و 200 نانوغرام يعمل بشكل أفضل (على سبيل المثال ، 800 نانوغرام mRNA لنقل 400,000 ضامة).
    1. اضرب الكمية المحسوبة من mRNA المطلوبة في العدد الإجمالي للآبار التي يجب نقلها (على سبيل المثال ، 4 آبار بها 400,000 بلاعم لكل منها: 4 × 800 نانوغرام = 3,200 نانوغرام mRNA مطلوب في المجموع لجميع الآبار). على سبيل المثال ، إذا كان مخزون الرنا المرسال الخاص بك 426.8 نانوغرام / ميكرولتر ، فستكون هناك حاجة إلى 7.49 ميكرولتر للتعداء الأمثل ل 4 آبار مع 400,000 ضامة لكل منها.
  4. أضف الحجم المحسوب للمخزن المؤقت لتعداء الرنا المرسال (الخطوة 5.1) مطروحا منه أحجام كاشف نقل الحمض النووي الريبي المرسال (الخطوة 5.2) و mRNA (الخطوة 5.3) إلى أنبوب التفاعل. على سبيل المثال ، 450 ميكرولتر - 9 ميكرولتر - 7.49 ميكرولتر = 433.51 ميكرولتر.
  5. قم بإذابة مخزون mRNA واخلطه عن طريق التقليب اللطيف لأنبوب الشطف. أضف الحجم المحسوب ل mRNA (الخطوة 5.3) إلى أنبوب التفاعل مع المخزن المؤقت لتفاعل mRNA (في المثال المقدم أعلاه: 7.49 ميكرولتر في 433.51 ميكرولتر).
  6. دوامة لمدة 5 ثوان وتدور لأسفل لمدة ثانية عند 2,000 × جم.
  7. دوامة كاشف نقل الرنا المرسال لمدة 5 ثوان وتدور لأسفل لمدة 2 ثانية عند 2,000 × جم.
  8. أضف الحجم المحسوب لكاشف تعداء الرنا المرسال (الخطوة 5.2) إلى أنبوب التفاعل الذي يحتوي على المخزن المؤقت لتعداء الرنا المرسال والحمض النووي الريبي المرسال (في المثال المعروض أعلاه: 9 ميكرولتر من كاشف تعداء الرنا المرسال).
  9. دوامة مزيج التعداء لمدة 5 ثوان وقم بالدوران لأسفل لمدة 2 ثانية عند 2,000 × جم.
  10. احتضن لمدة 15 دقيقة في RT.
  11. وفي الوقت نفسه ، استبدل وسط استزراع البلاعم بوسط استزراع طازج ودافئ (انظر الخطوتين 4.2.18 و 4.4.5).
  12. بعد خطوة الحضانة 5.10 ، أضف مزيج التعدي إلى الآبار التي تحتوي على البلاعم في حجم مناسب لحجم البئر (انظر الخطوة 5.1). أضف مزيج التعدي بالتنقيط في دائرة من الخارج إلى منتصف البئر.
  13. قم بهز اللوحة برفق ، أولا في اتجاه رأسي ثم في اتجاه أفقي لضمان التوزيع المنتظم لمزيج التعدي في البئر. ثم احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. سيبدأ تخليق البروتين المشفر بواسطة mRNA المنقول بعد فترة وجيزة من التعداد. للحصول على أفضل النتائج ، احتضن لمدة 6 ساعات على الأقل.
  14. بعد الحضانة ، قم بتحليل كفاءة التعدي عن طريق الفحص المجهري (المناعي) الفلوري ، أو قياس التدفق الخلوي ، أو اللطخة المناعية ، أو استخدم البلاعم المنقولة للتجربة التي تختارها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 5-ميثيل CTP (100 مليمتر) جينا بيوسيانس NU-1138S مخزنة في -20 درجة مئوية فوسفاتيز أنتاركتيكا نيو إنجلاند بيولابز M0289 مخزنة في -20 درجة مئوية المخزن المؤقت لتفاعل الفوسفاتيز في القطب الجنوبي (10X) نيو إنجلاند بيولابز ب 0289 مخزنة في -20 درجة مئوية الأجسام المضادة ل NEMO / IKKγ إنفيتروجين MA1-41046 مخزنة في -20 درجة مئوية الأجسام المضادة المضادة β الأكتين سيجما ألدريتش أ 2228 مخزنة في -20 درجة مئوية أطباق بتري 92,16 ملم مع كاميرات سارستيدت 8,21,473 مخزنة في RT CD11b Microbeads الفأر والإنسان ميلتيني بيوتيك 130-049-601 مخزنة في 4 درجات مئوية Cre recombinase + T7-Promotor التمهيدي الأمامي سيجما ألدريتش 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCCCCCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3 '، مخزن عند -20 درجة مئوية Cre recombinase + T7-Promotor التمهيدي العكسي سيجما ألدريتش 5 ′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3 ′ ، مخزنة عند -20 درجة مئوية طقم تنقية الحمض النووي: طقم تنقية QIAquick PCR كياجين هاتف: 28104 مخزنة في RT eGFP + T7-Promotor التمهيدي الأمامي سيجما ألدريتش 5'-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3 '، مخزن عند -20 درجة مئوية التمهيدي العكسي eGFP + T7-Promotor سيجما ألدريتش 5'-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3 '، مخزنة عند -20 درجة مئوية المخزن المؤقت سريع الهضم (10X) الترمو: العلمية ب 64 مخزنة في -20 درجة مئوية برنامج FastDigest XbaI الترمو: العلمية FD0684 مخزنة في -20 درجة مئوية بوليميراز عالي الدقة مع التدقيق اللغوي: Q5 DNA عالي الدقة - بوليميراز شركة نيو إنجلاند بيولابز M0491S مخزنة في -20 درجة مئوية IKKβ + T7-Promotor التمهيدي الأمامي سيجما ألدريتش 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3 ′ ، مخزنة عند -20 درجة مئوية IKKβ + T7-Promotor التمهيدي العكسي سيجما ألدريتش 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3 ′ ، مخزنة عند -20 درجة مئوية طقم نسخ الحمض النووي الريبي المرسال في المختبر: مجموعة HiScribe T7 ARCA mRNA (مع مخلفات polyA) نيو إنجلاند بيولابز E2060 مخزنة في -20 درجة مئوية أعمدة LS ميلتيني بيوتيك 130-042-401 مخزنة في RT ماك متعددة الحامل ميلتيني بيوتيك 130-042-303 مخزنة في RT المخزن المؤقت لنقل الرنا المرسال والكاشف: jetMESSENGER تعداء بول بلس 409-0001 دي مخزنة في 4 درجات مئوية طفرة IKKβ IKK-2S177 / 181E البلازميد أدجين هاتف 11105 مخزنة في -20 درجة مئوية بلازميد NEMOC54 / 347A متحولة أدجين هاتف: 27268 مخزنة في -20 درجة مئوية بلازميد pEGFP-N3 أدجين 62043 مخزنة في -20 درجة مئوية بولي (أنا: ج) كالبيوكيم 528906 مخزنة في -20 درجة مئوية بلازميد pPGK-Cre F.T. Wunderlich ، H. Wildner ، K. Rajewsky ، F. Edenhofer ، متغيرات جديدة من Cre recombinase المحفز: يظهر طفرة جديدة من بروتين اندماج Cre-PR حساسية محسنة ونطاقا موسعا من التحفيز. الأحماض النووية Res. 29 ، 47e (2001). مخزنة في -20 درجة مئوية زائف UTP (100 مل) جينا بيوسيانس NU-1139S مخزنة في -20 درجة مئوية فاصل QuadroMACS ميلتيني بيوتيك 130-090-976 مخزنة في RT الجسم المضاد CD11b المضاد للفئران ، مترافق APC بيو ليجند 101212 مخزنة في 4 درجات مئوية الجسم المضاد F4 / 80 المضاد للفئران ، مترافق PE العلوم البيولوجية الإلكترونية 12-4801-82 مخزنة في 4 درجات مئوية مؤتلف M-CSF بيبروتك 315-02 مخزنة في -20 درجة مئوية طقم تنقية الحمض النووي الريبي: طقم تنظيف النسخ MEGAclear ثيرموفيشر العلمي AM1908 مخزنة في 4 درجات مئوية الفاعل بالسطح المتحلل للRNASE: RnaseZAP سيجما ألدريتش R2020 مخزنة في RT LPS فائق النقاء من الإشريكية القولونية O111: B4 إنفيفوجين مخزنة في -20 درجة مئوية بلازميد IKKβ من النوع البري أدجين هاتف 11103 مخزنة في -20 درجة مئوية بلازميد NEMO من النوع البري أدجين هاتف: 27268 مخزنة في -20 درجة مئوية

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة