العلاج المناعي الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريبة للقضاء على الخلايا المستهدفة في الثقافات ثلاثية الأبعاد المختلطة

الملخص

المصدر: Sato ، K. et al. ، القضاء الانتقائي على الخلايا من ثقافة 3D مختلطة باستخدام تقنية العلاج المناعي الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريبة.J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو تقنية لإزالة خلايا معينة بشكل انتقائي من ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد المختلطة من خلال العلاج المناعي الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريبة. في هذه الطريقة ، يتم تحديد الخلايا المستهدفة بدقة باستخدام جسم مضاد مقترن بجهاز امتصاص ضوئي NIR. يؤدي التشعيع اللاحق بضوء الأشعة تحت الحمراء إلى موت الخلايا ، مما يؤدي بشكل فعال إلى القضاء على الخلايا المستهدفة من الثقافة ثلاثية الأبعاد.

البروتوكول

ملاحظة: يصف البروتوكول التالي الخطوات اللازمة للقضاء على خلايا معينة باستخدام العلاج المناعي الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR-PIT). يمكن العثور على عناصر التحكم والتفاصيل الأخرى حول NIR-PIT وقابلية الخلية للحياة في مكان آخر.

< p class = "jove_title" >1. اقتران الأشعة تحت الحمراء 700 (IR700) إلى الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb)

1. تحضير mAb محل الاهتمام عند 2-5 مجم / مل في محلول فوسفات هيدروجين ثنائي الصوديوم 0.1 M (Na₂HPO₄) (درجة الحموضة 8.6).
2. امزج 6.8 نانومول من mAb مع 30.8 نانومول من 10 mM IR700 في محلول 0.1 M Na₂HPO₄ (درجة الحموضة 8.6) في أنبوب طرد مركزي دقيق واحتضانه في RT لمدة ساعة واحدة ، مغطى بورق الألمنيوم.
3. اغسل عمود PD-10 (انظر جدول المواد / المعدات) ب 15 مل PBS ، مرتين. قم بتحميل العينة من الخطوة 1.2.
4. قم بتنقية الخليط عبر عمود PD-10 عن طريق شطف PBS وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. < / > ملاحظة: هنا ، كان الشطف على طول لون الشريط IR700. بالنسبة لعينة 300 ميكرولتر ، يتراوح جزء شطف PBS عادة بين 2.5 مل إلى 4.4 مل.
5. حدد تركيز البروتين باستخدام تلطيخ Coomassie عن طريق قياس الامتصاص عند 595 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. حدد تركيز IR700 مع الامتصاص عند 689 نانومتر لتأكيد عدد جزيئات الفلوروفور المترافقة مع كل جزيء mAb.
   ملاحظة: من المهم تحديد عدد الاقتران الأمثل لجزيئات IR700 في 1 مللي أمبير باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بشكل عام ، حوالي 3 جزيئات IR700 في جزيء 1 مللي أمبير هو الأمثل لكل من العمل في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن استخدام طرق الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) والرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE) لتأكيد ما إذا كان mAb و IR700 مرتبطين أم لا.
6. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد تحديد تركيز البروتين.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تحضير ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد المختلطة (كروية مختلطة)

1. ضع الماء المعقم (حوالي 1 مل) في قسم خزان اللوحة من ألواح الإسقاط المعلقة.
2. قم بإعداد نسب مختلفة من أنواع الخلايا ذات الأهمية - خلايا البروتين الفلوري الأخضر A431-luciferase الأخضر (A431-luc-GFP) وخلايا البروتين الفلوري الأحمر 3T3 (3T3-RFP) - مع احتواء كل عينة على 5,000 خلية إجمالا ، معلقة في 50 ميكرولتر من وسائط الاستزراع. < / > ملاحظة: قم بإعداد نسب 1: 100 ، 10: 100 ، 25: 100 ، 50: 100 ، إلخ ، لأنواع الخلايا ذات الأهمية في وسائط الثقافة اعتمادا على نوع الخلية.
3. احتضن المزيج لمدة 5-7 أيام في لوحة الإسقاط المعلقة بئر 96 في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير وسائط الثقافة كل يومين. ملاحظة: لجعل الكروي ثلاثي الأبعاد بدقة ، تعامل مع اللوحة برفق ، حيث تسقط القطرات التي تحتوي على الخلايا بسهولة قبل تشكيل أشكال ثلاثية الأبعاد.
4. راقب مورفولوجيا وحجم الكرات باستخدام مجهر المجال الساطع المقلوب بتكبير 10X - 40X. ملاحظة: على الرغم من أن ذلك يعتمد على أنواع الخلايا وحجم القطرة المعلقة ، تأكد من أن قطر الكروي يبلغ حوالي 400-600 ميكرومتر بعد 7 أيام من الحضانة في لوحة الإسقاط المعلقة 96 جيدا.

فئة

3. في المختبر NIR-PIT لثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد المختلطة

1. قم بتغيير وسائط ألواح الإسقاط المعلقة إلى 10 ميكروغرام / مل مترافق الأجسام المضادة الممتص للضوء (APC) المحتوية على وسائط ، واحتضانها لمدة 6 ساعات في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
2. بعد 6 ساعات من الحضانة ، اغسل الكروي مرتين بوسائط مزرعة جديدة (خالية من الفينول باللون الأحمر). انقل الكروي برفق إلى طبق زجاجي القاع مقاس 50 مم مع 100 ميكرولتر من وسائط مزرعة الفينول الأحمر الطازجة باستخدام طرف ماصة معقم سعة 200 ميكرولتر مع قطع الطرف. ضع كرويا واحدا في كل طبق.
3. راقب الكروي باستخدام مجهر المجال الساطع المقلوب للكشف عن تغير التشكل. لمراقبة المراسلين البصريين (على سبيل المثال ، GFP و RFP) ، استخدم المجهر الفلوري مع إعدادات المرشح التالية: GFP - مرشح الإثارة 469 نانومتر ، ومرشح انبعاث 525 نانومتر. RFP - مرشح إثارة 559 نانومتر ، ومرشح انبعاث 630 نانومتر.
4. ضع الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) فوق الطبق ذو القاع الزجاجي للإشعاع.
   ملاحظة: يمكن أن تتعرض الكرويات لضوء الأشعة تحت الحمراء إما على المجهر أو في الغطاء الرقائقي.
   1. قم بقياس كثافة الطاقة لضوء NIR باستخدام مقياس الطاقة البصرية. وفقا لهذا القياس ، قم بإشعاع ضوء NIR عبر الثنائيات الباعثة للضوء (LEDs) التي تنبعث منها الضوء بأطوال موجية تتراوح من 670 إلى 710 نانومتر عند 2 J / cm².
      ملاحظة: يمكن أن يخترق ضوء LED أقصى عمق يبلغ حوالي 5 بوصات. تعتمد التأثيرات السامة للخلايا ل NIR-PIT فقط على طاقة معينة بغض النظر عن كثافة الطاقة ومدة التعرض.
5. بعد التشعيع ، انقل الكروية إلى صفيحة إسقاط معلقة جديدة مع 50 ميكرولتر من وسائط الاستزراع الطازجة واحتضانها لمدة يوم واحد في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
6. انقل الكروي برفق إلى طبق ذو قاع زجاجي يحتوي على 100 ميكرولتر من وسائط الاستزراع الطازجة (خالية من الفينول الأحمر) باستخدام طرف ماصة معقم سعة 200 ميكرولتر مع قطع الطرف. راقب الكروي بالمجهر الفلوري بعد يوم واحد من NIR-PIT باستخدام إعدادات المرشح الموضحة في الخطوة 3.3.
   1. اكتشف الخلايا الميتة عن طريق إضافة يوديد البروبيديوم إلى الوسائط بتركيز نهائي قدره 2 ميكروغرام / مل ، أو عن طريق فقدان مضان GFP السيتوبلازمي باستخدام مجهر مضان (الشكل 1 ب).
7. كرر الخطوات 3.1-3.6 إذا لم يتم التخلص من الخلايا المستهدفة تماما.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. القضاء على الخلايا المستهدفة في الخلايا الكروية ثلاثية الأبعاد (الكرويات المختلطة لخلايا A431-luc-GFP و 3T3-RFP).(أ) يظهر نظام NIR-PIT (2 J / cm²). (ب) قضى NIR-PIT المتكرر تماما على الخلايا المستهدفة (A431-luc-GFP) دون أي ضرر للخلايا غير المستهدفة (3T3-RFP) ، في كروي مختلط ثلاثي الأبعاد. شريط = 200 ميكرومتر. (ج) أظهر ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات IRDye 700DX إستر صبغة الأشعة تحت الحمراء LI-COR Bioscience (لينكولن ، شمال شرق ، الولايات المتحدة الأمريكية) 929-70011 Na2HPO4 سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) S9763 عمود Sephadex G25 (PD-10) جنرال إلكتريك للرعاية الصحية (بيسكاتواي ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية) 17-0851-01 كوماس (برادفورد) بالإضافة إلى فحص البروتين شركة ثيرمو فيشر العلمية (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) بي -23200 لوحات إسقاط معلقة Perfecta3D 96 جيدا شركة 3D Biomatrix Inc (آن أربور ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية) HDP1096-8 عداد الطاقة الضوئية ثورلابس (نيوتن ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية) PM100 الصمام: L690-66-60 شركة ماروبيني أمريكا (سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) L690-66-60 فيكتيبيكس (بانيتوموماب) أمجين (ثاوزند أوكس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) طبق سفلي زجاجي 35 مم ، حجم الطبق 35 مم ، حجم البئر 10 مم سيلفيس (ماونتن فيو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) D35-10-0-N