عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم في دم الحبل السري لتوليد فئران الجهاز المناعي البشري

الملخص

المصدر: Lanis، J. M.، et al. اختبار العلاجات المناعية للسرطان في نموذج فأر متوافق مع البشر يحمل أورام بشرية. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو تقنية لتوليد فئران جهاز المناعة البشري (HIS). يتم عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم CD34 ⁺ (HSCs) من خلايا معطف دم الحبل السري البشري باستخدام حبات مغناطيسية مغلفة بالأجسام المضادة. يتم توسيع CD34 ⁺ HSCs في وسط نمو غني بالسيتوكينات وحفظه بالتبريد. أخيرا ، يتم حقن الخلايا الجذعية السرطانية المذابة في جرو فأر يعاني من نقص المناعة لإنشاء نموذج الفأر HIS.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد. تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. جيل الفئران

1. تربية الفئران من BALB / c -Rag2^null Il2RγC^فارغة Sirpα^NOD (BRGS) الفئران
   ملاحظه: هذه السلالة تعاني من نقص المناعة الشديد ، مع عدم وجود خلايا قاتلة طبيعية (NK). لذلك ، يجب استخدام تدابير صارمة لمنع العدوى الانتهازية. حافظ على المستعمرة على نظام غذائي يحتوي على تريميثوبريم وسلفاديازين على جدول زمني بالتناوب لمدة أسبوعين مع نظام غذائي عادي. الحفاظ على أعلى مستوى ممكن من غرفة السكن الاحترازية (على سبيل المثال ، مرفق دش حاجز مع وصول محدود).
   1. الحفاظ على مستعمرات BALB / c -Rag2^فارغة Il2RγC^فارغة Sirpα^NOD (BRGS) و BALB / c Rag2^فارغة Il2RγC^فارغة Sirpa^{Balb / c} (BRG) الفئران متماثلة اللواقح كمربين.
   2. قم بتربية BRGS^{N / N}×BRG^{B / B} لتوليد صغار BRGS^{B / N} ، لاستخدامها كمتلقين للخلايا الجذعية البشرية. في هذه المستعمرة ، تعتبر BRGS^{B / N} أكثر صحة من BRGS^{N / N} ، وتطعيم بمستويات مكافئة (أكثر من BRG).
2. CD34 + عزل الخلايا الجذعية البشرية من دم الحبل السري (CB)
   ملاحظه: لا يتم استخدام المضادات الحيوية لهذا الإجراء. لذلك ، فإن تقنية التعقيم الجيدة أمر حتمي.
   1. ضع رف أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، بالإضافة إلى أنابيب مخروطية 3 × 15 مل و ~ 10 × 50 مل في خزانة سلامة حيوية معقمة (BSC). رش كيس جمع الدم بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه يجف في BSC.
   2. احسب عدد الأنابيب المخروطية سعة 50 مل المطلوبة لعزل تدرج كثافة CB = حجم CB / 15 ، مقربا لأعلى وإلى رقم أنبوب زوجي. احسب حجم الدم لكل أنبوب = حجم CB / عدد الأنابيب. صب الدم بعناية من كيس CB في كل أنبوب مخروطي ؛ هذا هو 15 مل كحد أقصى لكل أنبوب. استخدم ماصة أوتوماتيكية وماصة مصلية سعة 25 مل لخلط الدم بنسبة 1:1 مع PBS معقم عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
   3. استخدم ماصة أوتوماتيكية على سرعة منخفضة وماصة مصلية سعة 10 مل لتسطيع الدم ببطء بمحلول تدرج بكثافة 1.077 جم/مل بدرجة حرارة الغرفة (RT) (انظر جدول المواد) دون إزعاج الواجهة. حافظ على طرف الماصة من ملامسة قاع الأنبوب. كرر لجميع الأنابيب. ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 850 × جم ، بدون فرملة ، في RT لضمان الحفاظ على تدرج الكثافة.
   4. تصور الطبقة الخلوية المصقولة فوق تدرج الكثافة 1.077 جم / مل كطبقة بيضاء غائمة. قم بإزالة طبقة البلازما والتخلص منها حتى حوالي 10 مل فوق الطبقة المصلية باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل وماصة أوتوماتيكية.
   5. اجمع المعطف المصقول باستخدام نقل معقم أو ماصة مصلية. استخدم الماصة مثل الملعقة لكشط الخلايا من جانب الأنبوب المخروطي أثناء تحرير البصلة (أو سحب العينة ببطء) لسحب الخلايا لأعلى. امزج المعاطف المصقولة من أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
   6. اغسل الخلايا عن طريق سكب 45 مل من محلول الملح المتوازن المعقم من هانكس (HBSS) الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) في كل أنبوب مخروطي. جهاز طرد مركزي لمدة 11 دقيقة عند 360 × جم عند RT.
   7. استنشق وسائط الغسيل إلى الحبيبات في جميع الأنابيب. استخدم ماصة مصلية سعة 10 مل وماصة أوتوماتيكية لإعادة تعليق الحبيبات الأولى في 10 مل من HBSS التي تحتوي على 2٪ FBS. أعد تعليق كل بيليه في نفس 10 مل من HBSS ، واشطف كل أنبوب ب 10 مل إضافي من HBSS لجمع جميع الخلايا في أنبوب واحد.
   8. صب 45 مل من HBSS المعقم الذي يحتوي على 2٪ FBS في الأنبوب المخروطي. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 360 × جم ، عند 4 درجات مئوية.
   9. قم بشفط مخزن الغسيل إلى حبيبات الخلية وأعد تعليق الحبيبات في 20 مل من المخزن المؤقت لفاصل الخلايا المغناطيسية (انظر جدول المواد). قم بإزالة كمية صغيرة لحساب الخلايا باستخدام مقياس الدمى عند تخفيف 1:20 باللون الأزرق الميثيلين. أضف عدد الخلايا الزرقاء والبيضاء. جهاز طرد مركزي عند 360 × جم ، لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية < br / > ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول تقنية الخرزة المغناطيسية (انظر جدول المواد). يمكن تعديل البروتوكول للاستخدام مع أي تقنية لفصل الخلايا ، مع نقاء وإنتاجية كافية للخلايا الجذعية CD34 +.
   10. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية CD34 + المعزولة من دم الحبل السري في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفاصل الخلايا المغناطيسية لكل 1 × 10⁸ خلايا. أضف 100 ميكرولتر من كاشف حجب مستقبلات Fc (FcR) أولا ، ثم 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي CD34 + لكل 1 × 10⁸ خلايا. احتضن عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة (بدون ثلج).
   11. أضف 5 مل من المخزن المؤقت لفاصل الخلايا المغناطيسية لكل 1 × 10⁸ خلايا وتدور عند 360 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر خطوة الغسيل وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفاصل الخلايا المغناطيسية لكل 1 × 10⁸ خلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يسمى "غير مجزأ".
   12. قم بتسمية أنبوبين مخروطيين آخرين سعة 15 مل "CD34-" و "CD34 +". ضع الأنابيب المخروطية الثلاثة سعة 15 مل (غير مجزأة ، CD34- ، و CD34 +) في الفتحات A1 و B1 و C1 ، على التوالي ، على رف التبريد (انظر جدول المواد). افصل الخلايا باستخدام برنامج الاختيار الإيجابي المكون من عمودين على فاصل الخلايا المغناطيسية التلقائي (انظر جدول المواد) في BSC ، وفقا لتعليمات أداة الشركة المصنعة.
3. توسيع وتجميد الخلايا الجذعية البشرية CD34+
   1. Aliquot 10 ميكرولتر من معلق الخلية CD34 + المستعاد (2 مل) على شريحة مقياس الدم وعد الخلايا تحت تكبير 10x. احسب العدد الإجمالي لخلايا CD34+ بضرب عدد الخلايا في 2 × 10⁴. اقسم إجمالي عدد خلايا CD34 + على 250,000 لحساب عدد القوارير المراد تجميدها (50,000 خلية لكل جرو فأر قبل التوسع في المختبر).
   2. قم بإعداد مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ من Iscove (FCS) من CB medium (بالإضافة إلى 1 مل إضافي لفقدان الترشيح) ، مكملا بعامل الخلايا الجذعية 40 نانوغرام / مل ، و 20 نانوغرام / مل من تيروزين كيناز 3 ليجند شبيه ب FMS (Flt3L) ، و 10 نانوغرام / مل إنترلوكين -6 (IL-6) ، وقم بالمرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر. أعد تعليق خلايا CD34 + عند 100,000 لكل مل من وسط CB ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية. في اليوم 3 ، أضف حجما مكافئا من وسط CB بدون السيتوكينات إلى القارورة التي تحتوي على الخلايا ووسط CB مع السيتوكينات.
      ملاحظه: تؤدي إضافة هذه السيتوكينات إلى وسط CB إلى تعزيز بقاء خلايا CD34 + وتمددها مع منع التمايز.
   3. احصد خلايا CD34 + الموسعة في اليوم 5. ماصة تعليق الخلية لأعلى ولأسفل وتجميعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف ما يكفي من وسط CB لتغطية قاع القارورة. باستخدام مكشطة الخلية ، اكشط الجزء السفلي من القارورة بالكامل. اجمع كل الوسائط في نفس الأنبوب سعة 50 مل ، وجهاز الطرد المركزي عند 360 × جم لمدة 11 دقيقة.
   4. أعد تعليق الخلايا في 2 مل من وسط CB. احتفظ بالقطرة الأخيرة من الماصة في صفيحة سعة 96 بئرا للعد. خفف الخلايا 1: 1 باللون الأزرق وأضف 10 ميكرولتر إلى مقياس الدم ، ثم عد الخلايا ومتوسطها من أربعة أرباع. احسب العدد الإجمالي لخلايا CD34+ بضرب عدد الخلايا في 4 × 10⁴ ، وسجل الجدوى.
   5. اصنع n + 1 مل من وسط التجميد ، حيث n هو عدد قوارير التجميد المحسوبة في الخطوة 1.3.1. تحضير وسط التجميد عن طريق إضافة 10٪ (حجم / حجم) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى FBS والحفاظ على الثلج. قم بتسمية cryovials ب CB # و CD34 + d5 والتاريخ.
   6. قم بتدوير خلايا CD34 + عند 360 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. Aliquot 1 مل من تعليق الخلية لكل قارورة وقسم أي باقي بالتساوي بين القوارير. أضف القوارير إلى مجمد خلية الأيزوبروبانول المبرد إلى 4 درجات مئوية ، ثم ضعها على حرارة -80 درجة مئوية ، ثم انقله إلى النيتروجين السائل لتخزينه لمدة >90 يوما.
4. تشعيع صغار الفأر
   1. اجمع صغار BRGS^{B / N} ، بعد 1-3 أيام من الولادة ، في صندوق بلاستيكي معقم به حشوة. أضف كمية صغيرة من الفراش مع الجراء. قم بتسمية الصندوق برقم القفص وعدد الجراء.
   2. قم بإعداد جهاز الإشعاع (انظر جدول المواد) للحصول على جرعة 300 راد. ضع صندوق الجراء في المبرد وقم بتعريضه إلى 300 راد. أعد الجراء إلى قفصهم ، وضعهم في كومة ، وغطيه بالفراش.
5. حقن الجرو وتحضير خلايا CD34 +
   1. ابدأ تحضير الخلية CD34 + ~ 3 ساعات بعد التشعيع. قم بتسخين 10 مل من وسائط CB في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. قم بتنفيذ جميع الخطوات في BSC المعقم.
   2. استرجع قارورة واحدة من خلايا CD34 + الموسعة والمجمدة في المختبر لكل أربعة إلى ستة صغار لحقنها. قم بإذابة الثلج بسرعة عند 55 درجة مئوية ، حتى تظهر كمية صغيرة من الثلج ، وأضف الخلايا إلى وسط CB الدافئ (يجب أن تظل القارورة باردة عند لمسها). استخدم 1 مل من الوسط لشطف كل قارورة وتدوير الخلايا عند 360 × جم لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية < / > ملاحظة: وجد أن الذوبان السريع عند 55 درجة مئوية ينتج عنه بقاء أفضل للخلية (90٪ -95٪) من الذوبان عند 37 درجة مئوية.
   3. استنشق الوسط بعناية. أعد تعليق الحبيبات (الصغيرة) في 2 مل من وسائط CB ، واخلطها برفق ، وأضف ~ 30 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى بئر واحد في لوحة العد. خفف 1: 1 باللون الأزرق ، ثم أضف 10 ميكرولتر إلى مقياس كثافة الدم وعد الخلايا ومتوسطها من أربعة أرباع.
   4. احسب العدد الإجمالي لخلايا CD34 + بضرب عدد الخلايا في 4 × 10⁴ ثم سجل الجدوى. تدور عند 360 × جم لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   5. قم بشفط الوسط بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من PBS المعقم لكل n + 1 جراء للحقن ، مما ينتج عنه 250,000-450,000 خلية CD34 + لكل فأر. ضع الأنبوب المخروطي على الثلج في حاوية نقل وانتقل إلى الحوض لحقن الجرو.
   6. أحضر مصباحا حراريا ، وحفاضات ، وحقنة سعة 1 مل ، وإبرة 18 جم ، وإبرة 30 جم ، ومستحضر خلية CD34 + في حاويات معقمة إلى vivarium BSC. ضع حفاضات معقمة ~ 2 قدم تحت المصباح الحراري. استرجع القفص مع القمامة المراد حقنها وضعها في BSC.
   7. قم بتجميع المحقنة بإبرة مشطوفة 18 جم. مطابقة زاوية الأنبوب المخروطي مع شطبة الإبرة ، امزج برفق وارسم تعليق الخلية. ضع الجراء على الحفاض لتدفئتها (راقب ارتفاع درجة الحرارة). قم بإزالة الهواء من المحقنة واستبدل إبرة 18 G بإبرة 30 G ، ثم ادفع المحقنة بحذر حتى يصبح تعليق الخلية عند طرف الإبرة.
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام حقنة الأنسولين.
   8. خذ جروا واحدا في كل مرة إلى حافة الحفاض بعيدا عن المصباح الحراري. شل حركة الجرو على جانبه تحت الإبهام والسبابة ، مما يسمح برؤية واضحة للوجه. لاحظ الوريد عبر الخد أسفل مكان الأذن. أدخل الإبرة بشكل ضحل في الوريد (IV) الأقرب إلى العين ، وحقن 50 ميكرولتر من الخلايا ببطء.
   9. تحقق مما إذا كانت الفقاعة تتشكل من الحقن تحت الجلد. إذا كان الأمر كذلك ، أدخل الإبرة بشكل أعمق وانتقل إلى حقن الخلايا. ستظهر قطرة صغيرة من الدم / الورم الدموي عند النجاح.
   10. مع استمرار الجرو في حالة تجميد ، قم بإجراء حقنة داخل الكبد (IH) مع 50 ميكرولتر أخرى من الخلايا (إجمالي 100 ميكرولتر لكل جرو IV + IH). يمكن تصور الكبد على أنه بقعة داكنة بين شريط الحليب الأبيض والقفص الصدري. ضع الجرو المحقون على حفاضات بعيدة عن الجراء غير المحقونة وتسخينها.
       ملاحظه: ينتج عن الحقن الوريدي خيم أفضل على المدى الطويل من حقن IH وحده ، لكن الحقن الوريدي لا ينجح دائما. لذلك ، فإن تقسيم الحقن بين IV و IH يضمن النقش في نسبة أكبر من الفئران.
   11. كرر حقن الوريد الوجهي وحقن IH لجميع الجراء. نظف أي دم ، وأعد الجراء إلى العش في قفصهم ، وقم بتغطيتها بالفراش.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1 مل حقنة مع إبر ماكيسون 1031815 أنابيب 15 مل Grenier Bio-One 188271 2-ميركابتو إيثانول سيغما M6250 أنابيب 50 مل Grenier Bio-One 227261 فاصل AutoMACS Pro ميلتيني 130-092-545 جيش صرب البوسنه فيشر ساينتيك BP1600100 تبريد 15 رف ميلتيني 130-092-952 الخلايا الجذعية الجنينية FCS جيبكو 10439001 أنابيب Eppendorf ؛ حجم 1.5 مل Grenier Bio-One 616201 تفوق مايكروسوفت FBS المعيار 100-106 500 مل فيكول هيباك جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 45001752 الماصات الزجاجية DWK علوم الحياة 63 أ 53 HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم سيغما 55037 ج مالتي راد 350 الأشعة السينية الدقيقة برنامج تلفزيوني كورنينج 45000-446 موشور لوحة الرسم البياني ريك هو FLT3L أنظمة البحث والتطوير 308-FK-005 / CF ريك هو IL6 أنظمة البحث والتطوير 206-IL-010 / CF تسجيل هو SCF أنظمة البحث والتطوير 255 إس سي 010 الماصات المصلية 25 مل فيشر ساينتيك 1367811 مرشح معقم نالجين 567-0020 المياه الجزيئية المعقمة سيغما 7732-18-5 محلل خلية اليتي بيو راد 12004279