$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تلقيح الخلايا
- تحضير الخلايا
- تأكد من الحفاظ على خط الخلية في الوسائط الموصى بها. على سبيل المثال ، حافظ على خط خلية WEHI 164 في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسط مكمل ب 2 ملي مولار L-glutamine ، و 10٪ مصل بقري جنين ، و 20 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك (HEPES) ، 0.05 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول ، 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين.
ملاحظه: خلايا المرور 3 مرات على الأقل وحتى 5 مرات بعد إزالتها من التخزين المبرد. لضمان بقاء الخلية المثلى ، يجب تقسيم الخلايا عندما تكون بين 70-80٪ ملتقية. يجب اختبار خطوط الخلايا السرطانية بحثا عن الميكوبلازما ، حيث يمكن للعدوى أن تغير نمو الخلايا وتؤثر على الاستجابة المناعية في الجسم الحي.
- قبل يوم واحد من التلقيح ، حلق الفئران في الجانب الأيمن السفلي باستخدام المقص.
ملاحظه: تم استخدام إناث الفئران BALB / c ، التي تتراوح أعمارها بين 8-12 أسبوعا ، ذات الوزن الطبيعي (16-22 جراما) في هذه التجربة.
- في يوم التلقيح ، حصاد WEHI 164 خلية عندما يلتقي 70-80٪ عن طريق التربسين.
- استنشق وسط المزرعة من قوارير زراعة الأنسجة ثم أضف محلول مخزن بالفوسفات المعقم (1x PBS) ، لإزالة الآثار المتبقية من مصل الأبقار الجنينية (FBS).
- استنشق PBS من قوارير زراعة الأنسجة. أضف 3 مل من 0.05٪ تريبسين (لقارورة T75) ثم قم بتدوير القارورة بحيث يتم تغطية سطح القارورة بالكامل بالخلايا بواسطة التربسين.
- احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية ، حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ 2 لمدة 3 دقائق. افحص الخلايا بشكل دوري ، من خلال النقر على جانبي القارورة لمعرفة ما إذا كانت الخلايا قد أزاحت.
- قم بإزالة القوارير من حاضنة زراعة الخلايا وأضف 5 مل من الوسائط المكملة ب FBS لتحييد التربسين.
ملاحظه: لا تترك الخلايا في التربسين لفترة أطول من اللازم ، لأن ذلك قد يتلف الخلايا ويؤدي إلى انخفاض قابلية الخلايا للبقاء.
- تعليق Pipet عدة مرات للحصول على تعليق خلية واحدة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل.
- خلايا الحبيبات عن طريق الدوران عند 350 × جم لمدة 3 دقائق.
- اغسل الخلايا ثلاث مرات في 1x PBS.
- أعد تعليق الخلايا في 50 مل من 1x PBS المعقم واغسل الخلايا عن طريق سحب تعليق الخلية لأعلى ولأسفل. خلايا الحبيبات عن طريق الدوران عند 350 × جم لمدة 3 دقائق.
- استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 15 مل من المعقم 1x PBS. اغسل الخلايا عن طريق سحب تعليق الخلية لأعلى ولأسفل. خلايا الحبيبات عن طريق الدوران عند 350 × جم لمدة 3 دقائق.
- استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل بالضبط من 1x PBS المعقمة. اغسل الخلايا كما في الخطوة 1.1.4.2 وانقل كمية صغيرة (حوالي 100 ميكرولتر) من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي للعد. خلايا الحبيبات عن طريق الدوران عند 350 × جم لمدة 3 دقائق.
- حدد رقم الخلية باستخدام طريقة استبعاد Trypan blue إما باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي. أعد تعليق الخلايا في معقم 1x PBS بتركيز 5 × 106 خلايا / مل. احتفظ بتعليق الخلية على الجليد.
ملاحظه: يجب أن تكون صلاحية الخلايا السرطانية مساوية أو أعلى من 80٪ لضمان نمو الورم القابل للتكاثر.
- التلقيح تحت الجلد
- امزج معلق الخلية جيدا واملأ حقنة بإبرة 26 جم مع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (5 × 105 خلايا) في 1x PBS معقم. كرر خلط الخلايا قبل تحميل المحقنة التالية.
ملاحظه: احتفظ بالخلايا على الجليد طوال الإجراء للحفاظ على البقاء.
- كبح جماح الماوس بشكل مناسب ، مما يضمن الوصول إلى الجانب السفلي الأيمن. تلقيح الفأر تحت الجلد على الجانب السفلي الأيمن المحلوق
ملاحظه: تأكد من عدم وجود التلقيح في الصفاق عن طريق رفع الإبرة قليلا ، والتي يجب أن تكون مرئية تحت الجلد. يجب أن تتشكل كتلة تشبه الفقاعة تحت الجلد بعد التلقيح.
- مراقبة الفئران كما هو مطلوب بموجب موافقة الأخلاقيات المعمول بها وإجراء الاستئصال الجراحي عندما تنمو الأورام إلى حجم حوالي 50 مم2.
< p class = "jove_title" >
2. الاستئصال الجراحي الجزئي للورم
ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول باحثين ؛ أحدهما للإجراءات الجراحية (SURGEON) ، والآخر لمراقبة الفئران (ASSISTANT).
- إعداد الجراحة
- في اليوم 12 بعد التلقيح ، عندما تصل الأورام إلى حجم 50 مم2 تقريبا ، جرعة الفئران مع 100 ميكرولتر (0.1 مجم / كجم) من البوبرينورفين في قفص الرقبة ، قبل 30 دقيقة من الجراحة.
- قم بإعداد المنطقة الجراحية بقطعة حرارة مغطاة بطبقة مقعد وقم بإعداد مخروط الأنف للتخدير. قم بتعقيم الأدوات الجراحية قبل الاستخدام ، وبين كل باستخدام معقم بالخرز الحراري ، مما يسمح للأدوات بالتبريد قبل الاستخدام. اجعل المعدات الجراحية التالية نظيفة وفي متناول اليد: الكلورهيكسيدين ، المسحة ، الشاش ، جل العين ، ملقطان منحنيان ، مقص ، قضيب مشبك ، مزيل القصاصة ، وعبوات القصاصات (الشكل 1 أ ، 1 ب).
- قم بتسخين غرفة التسخين إلى 37 درجة مئوية وقم بإعداد وسادة حرارية أخرى للاسترداد (الشكل 1 ج). ضع الأدوات المعقمة على سطح معقم مثل الوسادات المعقمة.
- تخدير
- ضع الماوس في غرفة الحث وقم بتخدير الفأر بنسبة 4٪ من الأيزوفلوران (4٪ في 100٪ أكسجين بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة) حتى يتباطأ معدل التنفس إلى حوالي 60 نفسا في الدقيقة (1 في الثانية) (يستغرق هذا عادة <1 دقيقة).
ملاحظه: لا تترك الفأر في الغرفة لفترة طويلة لأن ذلك قد يؤدي إلى الاختناق والموت. لديك فأر واحد فقط تحت التخدير في كل مرة.
- انقل الماوس إلى الوسادة الحرارية على طاولة الجراحة ، ضع الفأر مع أنفه في مخروط الأنف ، وحافظ على حالة التخدير مع 3-4٪ إيزوفلوران في 100٪ أكسجين بمعدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة. < / >
ملاحظه: يجب أن يراقب المساعد تنفس الفأر طوال الجراحة لضمان الحفاظ على المستوى الصحيح من التخدير. قم بخفض تركيز التخدير إذا أصبح التنفس بطيئا جدا أو قم بزيادة التركيز إذا كان عمق التخدير ضحلا جدا. إذا بدأ الفأر في اللهاث ، فقم بإزالة الفأر من مخروط الأنف ، وقلل من تركيز التخدير ، وانتظر حتى يعود التنفس إلى طبيعته قبل وضعه على مخروط الأنف مرة أخرى.
- قم بإجراء "اختبار قرصة" و "اختبار منعكس القرنية" للتأكد من تخدير الفأر بالكامل قبل بدء الجراحة. < / >
ملاحظه: حركة أي جزء من الماوس هي مؤشر على أن الماوس غير مخدر بالكامل. يجب إعطاء مخدرا إضافيا على الفور عن طريق زيادة تركيز التخدير.
- قم بتغطية عيون الفأر بكمية صغيرة من جل العيون لتجنب جفاف العين.
- الإجراء الجراحي
- امسح منطقة الجراحة 3 مرات باستخدام الكلورهيكسيدين الكحولي. باستخدام ملقط ومقص ، قم بعمل شق مستقيم بطول 1 سم على طول الجانب الظهري ، على بعد 3 مم من الورم (الشكل 2 أ ، 2 ب).
ملاحظه: يسمح توحيد الشق إلى 1 سم في كل فأر (باستخدام مسطرة) بتقييم متساو لالتئام الجروح بين الفئران. يسمح تحديد موقع الشق على بعد 3 مم من الورم بالعلاج المساعد داخل الورم اللاحق دون تسرب من الجرح.
- باستخدام الملقط، اسحب الوجه والأنسجة الدهنية تحت الجلد بين الورم والصفاق. عادة ما يرتبط الورم تحت الجلد بجانب الجلد.
- افتح الجرح عن طريق إمساك الجلد برفق على الجانب الحامل للورم باستخدام الملقط و "قلب" الورم بحيث يكون مرئيا في الخارج (الشكل 2C ، 2D).
ملاحظه: يجب أن يكون جزء الورم المراد إزالته أقرب إلى الفتحة للحصول على جلد كاف لإغلاق الجرح. احرص على عدم قطع الجلد عند إزالة الورم.
- باستخدام مقص ، اقطع كبسولة الورم إلى نصفين لإزالتها ، بدءا من قاعدة الورم الأقرب إلى الفتحة.
- لجراحة إزالة الطوابق بنسبة 50٪ ، قم بقطع منتصف الورم. باستخدام ملقط منحني ، اغرف جزء الورم المراد إزالته (50٪) ؛ اغرف أي بقايا من المنطقة الضخمة.
- ل 75٪ debulk, إجراء 50٪ debulk الورم كما في الجزء 2.3.5 أعلاه. ثم قم بقطع ال 50٪ المتبقية من الورم إلى النصف وقم بغرف 25٪ من الورم باستخدام ملقط منحني كما هو موضح أعلاه.
- إغلاق موقع الجراحة
- ضع الورم المتبقي مرة أخرى تحت الجلد ، وباستخدام الملقط ، اسحب اللوحات الجلدية معا واصطف الجلد على طول الجرح.
- امسك الجلد معا على بعد 5 مم من حافة الجرح ، واستخدم المشابك الجراحية لإغلاق الجرح ، بدءا من الجانب الأقرب إلى الملقط. ضع أكبر عدد ممكن من المشابك حسب الحاجة لضمان عدم تعرض أي أنسجة كامنة. بشكل عام ، يتم تطبيق ثلاثة إلى أربعة مقاطع مع فجوات 2 مم بين المقاطع.
ملاحظه: إذا لم يتم تطبيق أي مقاطع بشكل جيد، فقم بإزالتها باستخدام مزيل القصاصات واستبدلها بمقاطع جديدة.
- انتعاش الفئران
- اسمح للفئران بالتعافي عن طريق وضعها في غرفة التسخين الدافئة (37 درجة مئوية).
- ضع قفص الماوس على وسادة الحرارة. راقب الفئران في غرفة التسخين حتى تتعافى من التخدير (مستيقظة ومشي) ثم أعد الفئران إلى القفص. اترك القفص على وسادة الحرارة لمدة 10 دقائق أخرى ، حتى تصبح الفئران أكثر نشاطا.
- أعط الفئران طعاما رطبا وطريا. راقب الفئران بعد ساعة واحدة من الجراحة للتعافي وتأكد من بقاء المشابك في مكانها. تأكد من أن القفص نصف / نصف من الوسادة الحرارية للسماح للحيوانات بتنظيم درجة الحرارة ذاتيا أثناء عدم المراقبة.
- جرعة الفئران مع 0.1 مجم / كجم بوبرينورفين (100 ميكرولتر تحت الجلد في قفص الرقبة) بعد 6-8 ساعات من الجراحة (في نهاية اليوم). راقب الفئران في وقت مبكر من صباح اليوم التالي وجرعة الفئران مرة أخرى ب 0.1 مجم / كجم بوبرينورفين (100 ميكرولتر تحت الجلد في قفص الرقبة). أعط المزيد من الطعام الرطب حسب الحاجة.
- راقب الفئران يوميا خلال الأيام السبعة القادمة. يمكن إزالة المقاطع بعد سبعة أيام باستخدام مزيل المقاطع.
- العلاج المساعد أو المساعد الجديد
- عالج الفئران في الفترة المحيطة بالجراحة بالعلاج المساعد (الجديد) في أي وقت ، اعتمادا على العلاج المعني.
- على سبيل المثال ، عالج الفئران بجرعة واحدة من 100 ميكروغرام من مضادات CTLA-4 داخل الصفاق (IP) في اليوم 15 بعد التلقيح أو بثلاث جرعات من 200 ميكروغرام مضاد ل PD-1 IP. في اليوم 15 و 17 و 19 بعد التلقيح.
