تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. معالجة عينة من الجلد البشري المتبرع
ملاحظة: كانت عينة الجلد البشري المستخدمة في عملية الزرع هذه عبارة عن عينة كبيرة تم جمعها من بطن مريض سليم. يجب ألا تقل العينة عن 15 سم × 7.5 سم. قد تؤثر قيود الحجم على عدد الفئران التي يتوفر لها الجلد واختيار حجم الكسب غير المشروع.
- حافظ على عينة الجلد في درجات حرارة باردة (على الجليد ؛ 4 درجات مئوية) قبل التحضير والتطعيم. حافظ على رطوبة العينة في كوب مغلق لجمع العينات مع الشاش المنقوع في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
ملاحظة: لا ينصح بتخزين عينة الجلد عند 4 درجات مئوية لمدة تزيد عن يومين. ومع ذلك ، توجد تقارير حيث يتم تخزين عينات الجلد لفترة أطول.
أنذر: عالج جميع الأنسجة البشرية بالاحتياطات البيولوجية القياسية.
- استعد لجلدية عينة جلد الإنسان في غطاء مزرعة أنسجة الضغط السلبي المعقم على لوح تشريح معقم.
- ضع عينة الجلد ، بحيث تكون البشرة متجها لأعلى ، على لوح التشريح. امسح البشرة بقطعة تحضير كحولية معقمة ثم باستخدام PBS.
- قم بتثبيت الحافة الأقرب للجلد في مكانها باستخدام دبوس تشريح مقاس 1.5 بوصة (انظر جدول المواد).
- قم بإزالة عينة الجلد بسمك 400 ميكرومتر ، مع الضغط الثابت أثناء القطع للأمام بزاوية 30 درجة -45 درجة. اتبع جميع التعليمات الخاصة بالأدوات وتدابير السلامة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول تقنية Dermatome ، يرجى الاطلاع على التقرير المنشور مسبقا.
- قم بإعداد طبق بتري مقاس 100 مم × 20 مم عن طريق وضع شاش معقم منقوع في PBS معقم في قاع الطبق. ضع الجلد ، بحيث يكون جانب البشرة لأعلى ، على الشاش المبلل.
- قم بإغلاق حواف اللوحة وتغطيتها بغشاء مانع للتسرب شبه شفاف (انظر جدول المواد) للتأكد من عدم تلوث العينة. قم بتخزين العينة على حرارة 4 درجات مئوية قبل التطعيم.
< p class = "jove_title" >
2. تكييف وإعداد ما قبل الجراحة
- تجهيز الأدوات المعقمة ومحطة جراحية معقمة للتطعيم. استخدم المناشف الورقية المعقمة كأسطح معقمة لوضع الأداة والماوس.
ملاحظة: يمكن تطعيم الفئران بعد الفطام ولكن يفضل تطعيمها بين 8-10 أسابيع من العمر. يمكن تطعيم الفئران من كلا الجنسين.
- إجراء التحضير الجراحي ، مثل إزالة الشعر ، في منطقة منفصلة جسديا عن محطة الجراحة.
- تحضير مضاد GR1 (انظر جدول المواد) عن طريق تخفيفه إلى 1 مجم / مل في محلول ملحي معقم. جرعة كل فأر ب 100 ميكروغرام / 100 ميكرولتر من المحلول المضاد ل GR1 داخل الصفاق بعد تحريض التخدير.
- تخدير الفئران ، واحدة تلو الأخرى ، باستخدام الأيزوفلوران أو غيره من التخدير المعتمد مؤسسيا.
ملاحظة: يجب إعطاء الأيزوفلوران بتركيز 3٪ -5٪ أثناء الحث. بمجرد أن يصبح الفأر غير متحرك ، اخفض تركيز الأيزوفلوران إلى 1٪ -3٪ للتأثير على مدة الجراحة.
- راقب الماوس بحثا عن عمق التخدير المناسب من خلال مراقبة معدل التنفس ، وغياب استجابة قرصة إصبع القدم ، واللون الوردي المناسب للأذنين والفم.
أنذر: استخدم آلات التخدير وطرق التنظيف المناسبة ، وتجنب التعرض لأبخرة الأيزوفلوران.
- انقل الماوس إلى وسادة تدفئة أو مصدر حرارة آخر (انظر جدول المواد).
- قم بإدارة مرهم العين عن طريق وضع قطرة صغيرة من المرهم على العين بإصبع مرتديا قفازات.
- تطبيق المسكنات بوبرينورفين (0.08 ملغم/كغ) وكاربروفين (5 ملغم/كغ) (انظر جدول المواد) تحت الجلد عن طريق قرص الجلد والحقن بزاوية موازية للجسم. < / >
ملاحظة: إعداد تسكين ما قبل العلاج باتباع البروتوكولات المؤسسية. اتباع الإرشادات المؤسسية لاختيار وإعطاء المسكنات. تم توضيح طريقة التسكين المستخدمة في هذه الدراسة في الخطوة 2.7 والشكل 1.
- يتم تطبيق مضاد GR1 (المحضر في الخطوة 2.4) داخل الصفاق عن طريق رفع الفأر قليلا من الذيل ، وتعريض البطن ، والحقن بزاوية 30 درجة باستخدام حقنة الأنسولين 1 مل (12.7 مم).
- استخدم مقصات كهربائية آمنة للحيوانات (انظر جدول المواد) لحلق الأجزاء الوسطى والعلوية من الجانب الظهري للماوس.
- نظفي كل الشعر وضعي كمية وفيرة من مرهم إزالة الشعر على البشرة المحلوقة لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة.
- امسحي مرهم إزالة الشعر تماما بمنشفة ورقية و PBS.
< ص الفئة = "jove_title" >
3. إجراء الزرع
- انقل الماوس إلى موقع جراحي ثانوي بعيدا عن محطة إزالة الشعر.
قم - بتعقيم موقع الجراحة باستخدام عصا مسحة اليود بحركة دائرية ، بدءا من المنتصف والعمل باتجاه حافة المنطقة منزوعة الشعر.
- ضع قطعة من الغلاف البلاستيكي المعقم فوق الماوس واقطع نافذة في البلاستيك أكبر قليلا من حجم المنطقة المراد تطعيمها.
- قم بقص جزء مستطيل الشكل مقاس 10 مم × 10 مم من جلد المتبرع ليتم تطعيمه بمشرط. افعل ذلك عن طريق تثبيت جلد المتبرع بإحكام في مكانه مع الجانب الخلفي من الملقط والقطع بجانب الملقط بالمشرط.
- باستخدام المقص الجراحي ، قم بقص منطقة مستطيلة من جلد الفأر تتناسب مع حجم قطعة جلد المتبرع ، مما يؤدي إلى إنشاء سرير طعم. استخدم الملقط لسحب الجلد بعيدا عن الجسم ، وقم بقص الجلد بالمقص بزاوية بعيدا عن الجسم لتجنب قطع الوجه بعمق
- ضع قطعة جلد المتبرع ، بحيث تكون البشرة متجها لأعلى ، على فراش الكسب غير المشروع المجهز.
- باستخدام الجزء الخلفي من الملقط ، قم بمعالجة الجلد ، وانزلق ذهابا وإيابا حتى يصبح جلد المتبرع مسطحا تماما على طبقة الكسب غير المشروع.
- أضف قطرات من لاصق أنسجة الغراء الجراحي (انظر جدول المواد) حيث يلتقي جلد المتبرع بجلد الفأر ويمسك الفأر وجلد المتبرع مع ملقط لمدة 1-2 ثانية حتى يلتصق الغراء بالأنسجة. أغلق حافة الكسب غير المشروع تماما واترك الغراء يجف تماما.
- ضمادة الفئران (الشكل 2) باتباع الخطوات أدناه.
- قطع قطعة من شاش الفازلين (انظر جدول المواد) كبيرة بما يكفي لتغطية منطقة الكسب غير المشروع بالكامل.
- قم بتغطية الكسب غير المشروع بشاش الفازلين واضغط برفق على الشاش على الجلد باستخدام الملقط.
- قم بقص شريط من ضمادة الفيلم الشفافة بالطول بحيث يكون العرض كبيرا بما يكفي لتغطية جرح الفأر.
- اضغط بقوة على ضمادة الفيلم الشفافة ، الجانب اللاصق لأسفل ، فوق الشاش. قم بتدوير الماوس بسرعة للف الضمادة بالكامل حول الجذع ، مع التأكد من ملاءمتها بإحكام دون إعاقة التنفس ، وأن جميع الأطراف حرة للحركة.
- ضع الماوس في قفص الاسترداد وراقبه حتى يصبح في حالة تأهب ويتحرك. وفر مصدر حرارة على جزء من القفص لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد الاسترداد.
ملاحظة: من المتوقع أن تتعافى في غضون 1-5 دقائق بعد وضعها في قفص الاسترداد.
