تقنية لتوليد نموذج فأر Xenograft بشري مجسم ب PBMC

الملخص

المصدر: Li ، Z. ، et al. خلية أحادية النواة للدم المحيطي البشري (PBMC) مطعمة بنموذج Xenograft متوافق مع البشر لأبحاث الأورام المناعية الانتقالية (I-O). J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو فحصا لإنشاء نموذج فأر xenograft متوافق مع البشر. يتم حقن الفأر المصاب بنقص المناعة بالسيكلوفوسفاميد للتسبب في استنفاد الخلايا المناعية. يتم حقن الخلايا السرطانية المشتقة من المريض الممزوجة بخلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMCs) في هيدروجيل تحت الجلد في الفأر ، لتشكيل ورم به خلايا تائية متسللة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد. تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. إنشاء نموذج بشري قائم على PBMC

1. الاستئصال النقوي للفئران NOD / SCID باستخدام سيكلوفوسفاميد: تحديد الجرعات المثلى
   1. شراء الفئران الإناث غير البدنة السكرية / نقص المناعة المشترك الشديد (NOD / SCID) (6-8 أسابيع).
      ملاحظه: كانت جميع الفئران المشاركة في هذه الدراسة من الإناث.
   2. تحضير سيكلوفوسفاميد (CP) بجرعات مختلفة (50 و 100 و 150 مجم / كجم) في محلول ملحي. تحضير ديسولفيرام (DS) في 0.8٪ توين -80 في محلول ملحي بمعدل 125 مجم / كجم < br / > ملاحظة: تم إعداد تركيزات مختلفة من الشلل الدماغي لتمكين إعطاء كميات متساوية من محلول الدواء للفئران التي تحصل على جرعات مختلفة من الشلل الدماغي.
   3. علاج مع الشلل الدماغي (داخل الصفاق ، IP) و DS (الشمعي ، ص) مرة واحدة يوميا لمدة يومين. أعط DS (ص) 2 ساعة بعد كل جرعة من CP.
      ملاحظة: يقلل DS من السمية البولية للشلل الدماغي في الفئران ، وقد اقترح أن الشلل الدماغي جنبا إلى جنب مع الشلل الدماغي لديه قلة عدلات أطول أمدا من التي عولجت بالشلل الدماغي وحده. قد يحتاج نظام جرعات الشلل الدماغي إلى أن يكون محددا مسبقا قبل الدراسات الفعلية ووجد أنه يختلف اختلافا طفيفا بين سلالات الفئران المختلفة التي تعاني من نقص المناعة.
   4. جمع عينات الدم من الجيب الوريدي المداري ونقلها إلى الأنابيب المطلية بحمض البوتاسيوم إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA-K) على الجليد في اليوم 0 (1 ساعة قبل الجرعة الأولى) ، اليوم 2 (24 ساعة بعد الجرعة الثانية) واليوم 4 (72 ساعة بعد الجرعة الثانية).
   5. فحص تأثير الاستئصال النخاعي بعد علاج الشلل الدماغي ومتلازمة التصلب الدماغي عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). استخدم الفئران المضادة للفأر CD11b (M1 / 70) ، والفئران المضادة للفأر Ly6C (HK1.4) والفئران المضادة للفأر Ly6G (1A8) لبوابات CD11b ⁺ Ly6C^عالية مثل العدلات ، CD11b ⁺ Ly6C^عالية مثل الخلايا الوحيدة.
   6. سجل وزن الجسم والظروف الصحية للفئران يوميا لمدة أسبوع واحد. يتم تحديد الجرعة المثلى من CP و DS كنظام يؤدي إلى أقصى قدر من استنفاد العدلات والخلايا الوحيدة دون التسبب في سمية شديدة للفئران.
2. زرع PBMC البشري ونقش الورم: إعداد النموذج
   1. عزل PBMCs البشرية عن المتبرعين الأصحاء عن طريق الطرد المركزي المتدرج للكثافة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   2. عالج الفئران المصابة ب CP و DS مسبقا كما هو موضح في الخطوتين 1.1.2 و 1.1.3 لزيادة كفاءة الزرع.
   بعد
   3. 20 إلى 24 ساعة من الجرعة الثانية من CP و DS ، قم بحقن خط الخلايا السرطانية البشرية مثل خلايا A431 (ATCC ، 2.5 × 10⁶) و 5 × 10⁶ PBMCs معزولة (مختلطة في ما مجموعه 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 50٪ Matrigel) ، أو شظايا الورم (3 × 3 × 3 مم³ ، في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر من PBS يحتوي على 50٪ Matrigel) و 200 ميكرولتر من 5 × 10⁶ PBMCs (100 ميكرولتر لكل من الجانب الأيسر والأيمن من جزء الورم المطعم) تحت الجلد (SC) في الجناح الأيمن من.
   4. قم بقياس حجم الورم الأولي وسجله مرتين في الأسبوع لمدة 4-6 أسابيع.
      ملاحظه: سيتم القتل الرحيم للفئران بمجرد أن تفقد أوزان أجسامها أكثر من 20٪ أو يصل حجم الورم إلى 2,000 مم³ أو تقرح الورم.
   5. قتل الفئران في غرف الغاز بثاني أكسيد الكربون. اجمع أنسجة الورم بالكامل في الفئران المضحى بها بمقص العيون وقم بمعالجتها لتحليل الأنسجة والكيمياء المناعية (IHC). افحص تعبيرات CD8 و PD-1 و PD-L1 البشرية في هذه الأنسجة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات فصل PBMC / زراعة الخلايا هيستوباك -1077 سيغما هاتف: 10771 عزل الخلايا DMEM كورنينج 10-013-CVR زراعة الخلايا DPBS كورنينج 21-031-CVR زراعة الخلايا FBS كورنينج 35-076-السيرة الذاتية زراعة الخلايا البنسلين الستربتومايسين ، سائل جيبكو 15140-163 زراعة الخلايا التربسين EDTA (0.25٪) ، أحمر الفينول جيبكو 25200-114 زراعة الخلايا ماتريجيل كورنينج 356237 تطعيم CDX تحليل FACS ديوكسيربونوكلياز I من البنكرياس البقري سيغما DN25 تحضير العينة الكولاجيناز النوع الأول سيغما سي 0130 تحضير العينة الجسم المضاد للفأر / الإنسان CD11b (M1 / 70) بيو ليجند 101206 FACS الجسم المضاد Ly-6C (HK1.4) المضاد للفأر بيو ليجند 128008 FACS الجسم المضاد Ly-6G (1A8) المضاد للفأر بيو ليجند 127614 FACS الأجسام المضادة CD8 (OKT8) المضادة للإنسان Sungene Biotech H10082-11H FACS الجسم المضاد CD279 (MIH4) المضاد للإنسان العلوم البيولوجية الإلكترونية 12-9969-42 FACS الجسم المضاد CD3 المضاد للإنسان (HIT3a) 4A التكنولوجيا الحيوية -- FACS مقياس التدفق الخلوي من الجوافة easyCyte 8HT ميليبور 0500-4008 FACS زرع الورم / PDX / الجرعات / القياس سيكلوفوسفاميد جامو وكشمير Cat # 419656 ، CAS # 6055-19-2 فعالية في الجسم الحي ديسولفيرام جامو وكشمير Cat # 591123 ، CAS # 97-77-8 فعالية في الجسم الحي حقنة دينار بحريني 300841 تطعيم CDX الإبر تحت الجلد (14 جم) شنغهاي SA الطبية والبلاستيك المحدودة 0.7 * 32 تيراواط SB تطعيم PDX الفرجار الورنية (MarCal) مهر 16 ر. قياس الورم أقفاص التهوية الفردية IVC Lingyunboji المحدودة IVC-128 منشأة للحيوانات