تثبيط الالتهام الذاتي القائم على siRNA في الخلايا المتغصنة غير الناضجة المصابة بفيروس الهربس البسيط

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Düthorn، A.، et al. siRNA Electroporation لتعديل الالتهام الذاتي في الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية المصابة بفيروس الهربس البسيط من النوع 1. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تقنية صغيرة متداخلة تعتمد على الحمض النووي الريبي (siRNA) للتداخل مع التدفق الذاتي. يتم إدخال siRNA الذي يستهدف FIP200 mRNA في الخلايا المتغصنة غير الناضجة المشتقة من الخلايا الأحادية (iDCs) باستخدام التثقيب الكهربائي ، مما يتسبب في تدمير تعبير FIP200 ويؤدي إلى تثبيط اضطراب اللامين النووي عن طريق الالتهام الذاتي. عند إضافة فيروس الهربس البسيط (HSV) ، يتم تثبيط الخروج النووي للذرية الفيروسية بسبب عدم وجود اضطراب لامين عن طريق التدفق الذاتي.

البروتوكول

تم إنشاء DCs المشتقة من الخلايا الأحادية من منتجات فصادة الكريات البيض للمتبرعين الأصحاء. لهذا الغرض ، تم الحصول على تصويت إيجابي من لجنة الأخلاقيات المحلية (رقم المرجع 4556). أجريت تجارب هذه الدراسة وفقا لتوصيات لجنة الأخلاقيات في "جامعة فريدريش ألكسندر إرلانغن نورنبرغ" (رقم المرجع 4556). وافق جميع المانحين على موافقة خطية مستنيرة، بما في ذلك ما يتوافق مع إعلان هلسنكي.

< p class = "jove_title" >1. توليد ومعالجة الخلايا المتغصنة غير الناضجة (iDCs) والخلايا المتغصنة الناضجة (mDCs)

1. عزل خلايا الدم المحيطي البشرية أحادية النواة (PBMCs) من غرف نظام تقليل الصبغات البيضاء (LRSCs) كما هو موضح سابقا. تجنب الحفظ بالتبريد ل PBMCs واستخدمها مباشرة عند العزل للحصول على عوائد تيار مستمر أعلى.
2. قم بإنشاء DCs بشرية من PBMCs لمتبرعين أصحاء مختلفين في قوارير زراعة الخلايا T175 كما هو موضح سابقا. باختصار ، استخدم 350-400 مليون من PBMCs في 30 مل من وسط التيار المستمر (RPMI 1640 بدون L-glutamine ، 1٪ (v / v) مصل بشري من النوع AB (AB-serum) ، 100 U / مل بنسلين ، 100 مجم / مل ستربتومايسين ، 0.4 ملي ل-جلوتامين ، 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES)) لكل قارورة مزرعة خلية لعزل الخلايا الوحيدة عن طريق الالتصاق. بعد 1 ساعة ، اغسل الكسر غير الملتصق باستخدام RPMI 1640. أضف وسط DC طازجا مكملا بعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم 800 وحدة / مل (GM-CSF) و 250 وحدة / مل إنترلوكين -4 (IL-4) ، واحتضنه لمدة 3 أيام.
   1. في اليوم 3 بعد الالتصاق ، أضف 5 مل من وسط التيار المستمر الطازج الذي يحتوي على GM-CSF و IL-4 بتركيز نهائي يبلغ 400 وحدة / مل و 250 وحدة / مل لكل قارورة زراعة خلية ، على التوالي ، لتمايز التيار المستمر.
   2. لحصاد iDCs ، اشطف iDCs غير الملتصقة برفق من قاع قارورة زراعة الخلية ، في اليوم 4 بعد الالتصاق. كرر هذه الخطوة 2 مرات. لتوليد mDCs ، أضف كوكتيل النضج المكون على النحو التالي: GM-CSF (التركيز النهائي: 40 وحدة / مل) ، IL-4 (التركيز النهائي: 250 وحدة / مل) ، إنترلوكين -6 (IL-6 ، التركيز النهائي: 1000 وحدة / مل) ، إنترلوكين -1 بيتا (IL-1β ، التركيز النهائي: 200 وحدة / مل) ، عامل نخر الورم ألفا (TNF-α ، التركيز النهائي: 10 نانوغرام / مل) ، البروستاجلاندين E2 (PGE2 ؛ التركيز النهائي: 1 ميكروغرام / مل).
   3. بعد ستة أيام من الالتزام (بعد يومين من تحريض النضج باستخدام كوكتيل السيتوكين) ، اشطف mDCs من أسفل قارورة زراعة الخلية. كرر هذه الخطوة مرتين.
      ملاحظه: يمكن إنشاء DCs غير الناضجة والناضجة بالتتابع من متبرعين متطابقين في قارورة زراعة خلية واحدة. للقيام بذلك ، (أنا) افصل العدد المناسب من iDCs و (2) تحفز نضوج الخلايا المتبقية في القوارير باستخدام كوكتيل السيتوكين المدرج في الخطوة 1.2.2.
3. نقل iDCs أو mDCs في وسط زراعة الخلية المعني إلى أنابيب سعة 50 مل. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
   1. أعد تعليق التيار المستمر (= غسله) برفق في 5-10 مل من RPMI 1640 لكل قارورة مزرعة خلية. اجمع بين تعليق التيار المستمر في أنبوب واحد.
   2. حدد رقم الخلية باستخدام غرفة عد أو طريقة بديلة. تجنب التغيرات في درجة الحرارة عند التعامل مع وحدات التحكم iDC، لتقليل مخاطر التغيرات المظهرية.

2. تحليلات قياس التدفق الخلوي لمراقبة حالة نضج النمط الظاهري

1. انقل وحدات التداخل الترددي (iDC) أو mDCs (0.5 × 10⁶) من الخطوة 1.3.1 إلى أنبوب سعة 1.5 مل. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3390 × جم لمدة 1.5 دقيقة. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام FACS المؤقت (PBS مكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 2٪ (FCS)).
2. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الأجسام المضادة (FACS buffer) الذي يحتوي على أجسام مضادة محددة تحمل علامة الفلوروكروم ضد جزيئات سطحية محددة.
   1. استخدم الأجسام المضادة التالية للتحقق من النقاء (CD3- فلوريسين إيزوثيوسيانات [FITC] ، CD14- phycoerythrin [PE]) بالإضافة إلى حالة نضج DCs (CD80-PacBlue [Pacific Blue] / -PE- cyanine5 [Cy5] ، CD11c-PE-Cy5 ، CCR7-PE-Cy7 ، CD83-APC ، CD86-PE ، MHCII-APC-Cy7).
   2. قم بإعداد عينة واحدة غير ملطخة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS كعنصر تحكم.
   3. تلطخ الخلايا على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.
3. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين في 1 مل من المخزن المؤقت FACS وجهاز الطرد المركزي عند 3390 × جم لمدة 1.5 دقيقة.
4. أخيرا ، قم بإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول FACS المكمل بنسبة 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) وتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن تخزين الخلايا الثابتة عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى يومين.

فئة

3. تداخل التدفق الذاتي الناجم عن HSV-1 عن طريق التثقيب الكهربائي ل iDCs باستخدام FIP200-siRNA

ملاحظة: تم تعديل البروتوكول الحالي للتثقيب الكهربائي siRNA من Prechtel et al. (2007) و Gerer et al. (2017).

1. انقل DCs iDCs (12 × 10⁶) في اليوم 3.5 بعد الالتصاق إلى أنبوب سعة 50 مل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. في موازاة ذلك ، قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لمراقبة حالة النضج كما هو موضح في الخطوة 2 (استخدم الحياة / البنفسجي الميت بدلا من CD80-PacBlue).
2. اغسل وحدات التحكم المدمجة iDCs برفق في 5 مل من OptiMEM بدون أحمر الفينول وقم بطرد الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق iDCs برفق في 200 ميكرولتر من OptiMEM بدون أحمر الفينول ، مع ضبط تركيز الخلية 6 × 10⁶/100 ميكرولتر. لا تضع الخلايا على الجليد وتجنب التغيرات في درجة الحرارة. المضي قدما بسرعة وتجنب فترات الحضانة الطويلة ل iDCs في OptiMEM بدون أحمر الفينول.
3. انقل إما 75 ملي مول من siRNA الخاص ب FIP200 أو 75 pmol من siRNA المخفوق ، كعنصر تحكم ، إلى كوفيتات كهربائية مقاس 4 مم وأضف 100 ميكرولتر (6 × 10⁶ خلايا) من تعليق الخلية. نبض iDCs مباشرة باستخدام جهاز التثقيب الكهربائي I ، مع تطبيق الإعدادات التالية: 500 فولت لمدة 1 مللي ثانية.
   1. قبل الإجراء التجريبي ، قم بإعداد معلقات siRNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج والاحتفاظ بها على الجليد عند استخدام siRNAs هذه للتثقيب الكهربائي. قبل التثقيب الكهربائي للعينات ، قم بإجراء نبضة اختبار.
4. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بنقل iDC مباشرة إلى ألواح ذات 6 آبار مع وسط DC جديد مدفأ مسبقا (مكمل ب 40 وحدة / مل من GM-CSF و 250 وحدة / مل من IL-4). قم بزرع الخلايا بتركيز نهائي 1 × 10⁶ / مل وضعها في حاضنة. لا تشطف الخلايا من الكوفيت الكهربائي.
5. بعد 48 ساعة ، افحص أولا مورفولوجيا iDCs المجهرية. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا باستخدام مكشطة الخلايا ونقلها إلى أنابيب سعة 15 مل. اشطف الآبار ب 1 مل من PBS مكملا بحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك بنسبة 0.01٪ (EDTA) وانقل المحلول في الأنابيب المعنية.
6. بعد ذلك ، قم بتقسيم 6 × 10⁶ iDCs لكل حالة siRNA كما هو موضح في الخطوات التالية.
   1. استخدم 0.5 × 10⁶ خلايا لتقييم حالة النضج وصلاحية الخلية كما هو موضح في الخطوة 2. استخدم الأجسام المضادة التالية: CD11c-PE-Cy5 و CCR7-PE-Cy7 و CD83-APC و MHCII-APC-Cy7 و Life/Dead Violet.
   2. استخدم 1 × 10⁶ خلايا لتحليلات اللطخة الغربية للتحقق من كفاءة الضربة القاضية الخاصة ب FIP200. انقل الخلايا وحصادها إلى أنبوب قفل آمن سعة 1.5 مل عن طريق الطرد المركزي عند 3390 × جم لمدة 1.5 دقيقة. تحضير محللات الخلايا وإجراء تحليلات اللطخة الغربية.
   3. استخدم الخلايا المتبقية (4.5 × 10⁶) لتجارب عدوى فيروس الهربس البسيط -1. لكل حالة تجريبية ، قم بنقل 2.25 × 10⁶ iDCs إلى أنابيب 2 مل وإما إصابتها ب HSV1 بتعدد العدوى (MOI) 2 أو إضافة مخزن MNT كعنصر تحكم وهمي. قم بإجراء العدوى كما هو موضح.
   4. بعد 20 ساعة من الإصابة (hpi) ، قم بحصاد الخلايا باستخدام مكشطة الخلايا وقم بإعداد محللات الخلايا لتحليلات اللطخة الغربية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 4D-Nucleofector الوحدة الأساسية (جهاز التثقيب الكهربائي II) لونزا (بازل ، سويسرا) AAF-1002B AB-مصل Sigma Aldrich Chemie GmbH (شتاينهايم ، ألمانيا) H4522 زراعة الخلايا الشجيرية ACD-A Sigma-Aldrich Chemie GmbH (شتاينهايم ، ألمانيا) 9007281 Amaxa P3 خلية أولية 4D-Nucleofector X Kit L (جهاز طقم التثقيب الكهربائي II) لونزا (بازل ، سويسرا) V4XP-3024 Amersham ECL Prime Western Blotting Detecting كاشف جنرال إلكتريك للرعاية الصحية (سولينجن ، ألمانيا) RPN2232 كشف اللطخة الغربية بيرسلفات الأمونيوم (APS) Sigma Aldrich Chemie GmbH (شتاينهايم ، ألمانيا) أ 3678 مضاد للماوس IgG (فأر ، متعدد النسيلة ، HRP) إشارات الخلية (ليدن ، هولندا) 7076 [م] كشف اللطخة الغربية مضاد للأرانب IgG (ماعز ، متعدد النسيلة ، HRP) إشارات الخلية (ليدن ، هولندا) 7074 كشف اللطخة الغربية BD FACS Canto II مقياس التدفق الخلوي BD Biosciences (هايدلبرغ ، ألمانيا) 338962 غرفة النشاف Fastblot B44 Biometra (غوتنغن ، ألمانيا) 846-015-100 CCR7 (الماوس ، Pe-Cy7) BioLegend (، ألمانيا) 557648 قياس التدفق الخلوي
التخفيف: 1:100
استنساخ: G043H7 CD11c (الماوس ، Pe-Cy5) BD Biosciences (هايدلبرغ ، ألمانيا) 561692 قياس التدفق الخلوي
التخفيف: 1:100
استنساخ: B-ly6 CD14 (الماوس ، PE) BD Biosciences (هايدلبرغ ، ألمانيا) 555398 قياس التدفق الخلوي
التخفيف: 1:100
استنساخ: M5E2 CD3 (الماوس ، FITC) BD Biosciences (هايدلبرغ ، ألمانيا) 555332 قياس التدفق الخلوي
التخفيف: 1:100
استنساخ: UCHT1 CD80 (ماوس ، V450) BD Biosciences (هايدلبرغ ، ألمانيا) 560442 قياس التدفق الخلوي
التخفيف: 1:100
استنساخ: L307.4 CD83 (الماوس ، APC) eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold ، ألمانيا) 17-0839-41 قياس التدفق الخلوي
التخفيف: 1:200
استنساخ: HB15e CD86 (الماوس ، PE) BD Biosciences (هايدلبرغ ، ألمانيا) 553692 قياس التدفق الخلوي
التخفيف: 1:100 EVOS FL تصوير الخلايا نظام AMG / تقنيات الحياة (كارلسباد ، الولايات المتحدة الأمريكية) AMF4300 FIP200 (أرنب) إشارات الخلية (ليدن ، هولندا) هاتف 12436 كشف اللطخة الغربية
التخفيف: 1: 1000
استنساخ: D10D11 جهاز Gene Pulser II (جهاز التثقيب الكهربائي I) BioRad Laboratories GmbH (ميونيخ ، ألمانيا) 165-2112 GM-CSF (4x104 U/مل) Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach ، ألمانيا) 130-093-868 HLA-DR (الماوس ، APC-Cy7) BioLegend (، ألمانيا) 307618 قياس التدفق الخلوي
التخفيف: 1:200
استنساخ: L243 HSV-1/17 + / CMV-EGFP / UL43 بيوفيكس عدوى DC IL-1β (0.1 × 106 وحدة / مل) Cell Genix GmbH (فرايبورغ ، ألمانيا) 1411-050 IL-4 (1x106 U / مل) Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach ، ألمانيا) 130-093-924 IL-6 (1x106 U / مل) Cell Genix GmbH (فرايبورغ ، ألمانيا) 1404-050 طابعة ImageQuant LAS 4000 جنرال إلكتريك للرعاية الصحية (سولينجن ، ألمانيا) 28955810 ل-جلوتامين لونزا (بازل ، سويسرا) 17-605 [إ] طقم وصمة عار الخلايا الميتة البنفسجي القابل للإصلاح LIVE / DEAD تقنيات الحياة (كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) L34964 تلطيخ L / D في قياس التدفق الخلوي ليمفاوريب Alere Technologies AS (أوسلو ، النرويج) 04-03-9391/01 كلوريد المغنيسيوم Carl Roth GmbH (كارلسروه ، ألمانيا) أ537.1 ميجافوجي 2.0 RS هيريوس (هاناو ، ألمانيا) 75015505 غرفة عد نيوباور العلامة التجارية (فيرتهايم ، ألمانيا) 717805 قوارير زراعة الخلايا Nunc (175.0 سم 2) Thermo Scientific (روكفورد ، الولايات المتحدة الأمريكية) هاتف: 159910 بارافورمالدهايد ، 16٪ ألفا إيسار ، هافرهيل ، الولايات المتحدة الأمريكية 43368.9 مليون بيرفكت سبين 24 بلس Peqlab (إرلانغن ، ألمانيا) C2500-R-PL PGE2 (1 مجم / مل) فايزر (برلين ، ألمانيا) BE130681 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لونزا (بازل ، سويسرا) 17-512 فهرنهايت RestoreTM Western Blot Stripping Buffer ثيرمو ساينتفيك ، روكفورد ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف 21059 منصة هزاز بالوزن 15 Biometra (غوتنغن ، ألمانيا) 042-590 روتي بلوك Carl Roth GmbH (كارلسروه ، ألمانيا) أ151.4 روتي تحميل 1 (4x) Carl Roth GmbH (كارلسروه ، ألمانيا) ك 929.3 جل روتيفوريز 30 (37.5: 1) Carl Roth GmbH (كارلسروه ، ألمانيا) 3029.1 RPMI 1640 لونزا (بازل ، سويسرا) 12-167 فهرنهايت كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) Carl Roth GmbH (كارلسروه ، ألمانيا) 2326.2 [إ] راحة Thermomixer Eppendorf (هامبورغ ، ألمانيا) 5355 000.011 TNF-α (10 ميكروغرام/مل) Peprotech (هامبورغ ، ألمانيا) 300-01 أ تريس Carl Roth GmbH (كارلسروه ، ألمانيا) 4855.3 محلول تريبان الأزرق (0.4٪) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (شتاينهايم ، ألمانيا) تي 8154 توين 20 Carl Roth GmbH (كارلسروه ، ألمانيا) 9127.1 Whatman 0.2 ميكرومتر غشاء النيتروسليلوز جنرال إلكتريك للرعاية الصحية (سولينجن ، ألمانيا) 10600001 ورق كروماتوغرافيا WhatmanTM 3 مم Chr Fisher Scientific GmbH (Schwerte ، ألمانيا) 3030917