تقييم الفعالية المضادة للورم لبروتين معدل المناعة البكتيري في نموذج الفئران

الملخص

المصدر: Codolo، G. et al. تقييم فعالية بروتين الملوية البوابية HP-NAP كأداة علاجية لعلاج سرطان المثانة في نموذج الفئران التقويمي.J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو تقنية لتقييم النشاط المضاد للورم لبروتين تنشيط العدلات الملوية البوابي ، أو HP-NAP ، في نموذج سرطان المثانة الفأر. يتفاعل HP-NAP مع عدلات الخلايا السرطانية لإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، مما يؤدي إلى تمايز الخلايا التائية الساذجة إلى الأنماط الظاهرية للخلايا التائية من النوع 1 (Th1) والنوع 1 السامة للخلايا (Tc1). تفرز خلايا Th1 و Tc1 إنترفيرون جاما ، مما يثبط تكوين الأوعية الدموية للورم ويعزز تدمير الورم بوساطة الخلايا التائية السامة للخلايا ، مما يقلل من حجم الورم.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1.

1. تنمو إناث الفئران C57BL6 / J إلى عمر 8 أسابيع في أقفاص ذات تهوية فردية مع مرشحات العزل المجهري.
   ملاحظة: يفضل الإناث لأن التشكل التشريحي لجهازهن البولي التناسلي الخارجي يجعل القسطرة أسهل من الذكور.

< p class = "jove_title" >2. ثقافة الخلية

1. الحفاظ على خط خلايا سرطان الظهارة البولية للفأر MB49 في وسط RPMI 1640 مكمل بمصل بقري جنين معطل بالحرارة بنسبة 10٪ و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين عند 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون المرطب بنسبة 5٪ (CO₂).
2. تنمو خلايا MB49 في قوارير T-75 إلى التقاء 80٪. قم بالتربسين وإعادة التعليق عند 0.5 × 10⁵ - 0.5 × 10⁶ خلايا لكل 150 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) قبل الزرع في الفئران.

< p class = "jove_title" >3. زرع الورم داخل المثانة

1. تخدير الفئران باستخدام مزيج من مخدر الزوليتيل والزيلور (33 مجم / كجم و 20 مجم / كجم ، على التوالي) ، يتم حقنها داخل الصفاق.
2. ضع في وضع ضعيف وقم بتثبيت الأرجل الخلفية على الوسادة بشريط سكوتش. يجب فصل الكفوف بشكل كاف لجعل الصماخ الإحليلي مرئيا جيدا ويمكن الوصول إليه بسهولة لإدخال القسطرة.
3. ملاحظة: بالنسبة للقسطرة ، فإن القسطرة الوريدية للأطفال 24 جم مناسبة للفئران التي تتراوح أعمارها بين 8 و 10 أسابيع. يعد اختيار القسطرة أمرا بالغ الأهمية لتجنب تسرب السوائل بين جدار مجرى البول والقسطرة. يجب استخدام القسطرة ذات التجويف الأكبر للفئران الأكبر حجما أو الأكبر سنا.
4. باستخدام قراصة صغيرة ، اضغط على حافة واحدة من الجزء الخارجي من مجرى البول ولفها برفق شديد باتجاه "نهاية الرأس" للفئران. هذا الإجراء يعرض الصماخ المجرى البولي.
5. قم بإزالة الإبرة الداخلية للقسطرة وأدخل الأخيرة في مجرى البول بزاوية 45 درجة ، موجهة قليلا نحو "نهاية الذيل" للفئران. لا تجبر على دخول القسطرة. في حالة المقاومة ، ما عليك سوى لف القسطرة برفق شديد حتى تنزلق داخل مجرى البول. عندما يكون حوالي 0.5-0.8 سم من القسطرة في مجرى البول ، ضع القسطرة بعناية موازية لذيل الفئران وأدخلها بالكامل.
6. باستخدام حقنة سعة 1 مل ، يجب إدخال إبرتها في القسطرة ، اغسل المثانة من البول المتبقي عن طريق حقن 200-300 ميكرولتر من PBS المعقم وشفط كل السائل من المثانة.
7. ملاحظة: عند حقن PBS ، تمتلئ المثانة ، وسيكون التورم مرئيا بين الأرجل الخلفية للفئران ؛ وهذا يؤكد أن القسطرة صحيحة. تحتوي معظم القسطرة على حجم ميت يجب مراعاته عند حساب حجم الحقن.
8. باستخدام حقنة معقمة سعة 1 مل ، قم بحقن 200 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 0.1 نيوتن (HCl). املأ المثانة لحرق جدارها بالكامل. بعد 10 ثوان ، قم بإزالة كل الحمض وقم بتحييده على الفور عن طريق حقن 200 ميكرولتر من 0.1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بحقنة معقمة. في حالة حقن أكبر عدد من الخلايا (0.5 × 10⁶) ، فإن خطوة التحمض غير مطلوبة.
9. استنشق كل السائل المتبقي واغسل التجويف على الفور ب 300 ميكرولتر من PBS المعقم.
10. أفرغ المثانة عن طريق الشفط وحقن 150 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على خلايا MB49 (النطاق 0.5 × 10⁵ - 0.5 × 10⁶) في المثانة. اترك المحقنة مجمعة في القسطرة لتجنب تسرب الخلايا. من الأفضل تأمين المحقنة عن طريق تثبيتها على الوسادة بشريط سكوتش.
11. بعد ساعة واحدة ، قم باستخراج القسطرة برفق من مجرى البول وضع الفئران في القفص تحت مصباح متوهج حتى تستيقظ: يحدث هذا عادة بين 1 و 2 ساعة بعد نهاية العلاج.

فئة

4. التوصيل داخل المثانة للبروتين المنشط للعدلات الملوية البوابية (HP-NAP)

1. ملاحظة: بعد 3 أيام على الأقل من تقطير الخلايا ، من الممكن بدء العلاج.
2. القسطرة كما هو موضح في الخطوات 3.1 إلى 3.4. في هذه المرحلة ، ليس من الضروري حرق جدار المثانة باستخدام حمض الهيدروكلوراي.
3. باستخدام حقنة 1 مل ، اغسل المثانة من البول المتبقي عن طريق حقن 200-300 ميكرولتر من PBS المعقم وشفط كل السائل من المثانة.
4. حقن 50 ميكروغرام من HP-NAP لكل 150 ميكرولتر من PBS في المثانة. اترك المحقنة متصلة بالقسطرة لتجنب تسرب محلول البروتين. قم بتأمين المحقنة عن طريق تثبيتها على الوسادة بشريط لاصق.
5. بعد 1 ساعة ، أخرج القسطرة برفق من مجرى البول وضع الفئران في القفص تحت مصباح متوهج حتى تستيقظ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات C57BL / 6J إناث الفئران هارلان إيطاليا (أوديني ، إيطاليا) خلايا MB49 تم الحصول عليها من البروفيسور أودونيل ، كلية الطب بجامعة أيوا كارفر ، أيوا ، الولايات المتحدة الأمريكية RPMI سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) R8758 FBS سيجما ألدريتش F7524 برنامج تلفزيوني سيجما ألدريتش د1408 10X ، يتم تخفيفه في الماء الجزئي قارورة بيكتون ديكنسون (فرانكلين ليكس ، نيو جيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية) 353135 حقنة 1 مل بيكتون ديكنسون 301358 التربسين تقنيات الحياة (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) جنتاميسين تقنيات الحياة 15710-049 زيلور السيرة الذاتية 98 s.r.l. (ميلانو ، إيطاليا) 2٪ زيلازين زوليتيل فيرباك (كاروس ، فرنسا) 3.59713ه +11 5٪ زولازيبام + 5٪ تيليتامين قسطرة 24G تيرومو (روما ، إيطاليا) ريال سعودي + DM2419PX حمض الهيدروكلوريك كارلو إربا كواشف (ميلانو ، إيطاليا) 403871 سائل هيدروكسيد الصوديوميوم جي تي بيكر (سنتر فالي ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) 10095011 ذرور