قمع تكاثر فيروس التهاب الكبد B باستخدام الخلايا التائية الخاصة بمستضد الفيروس

Abstract

< p class = "jove_content" >المصدر: Xiong، X.، et al. الخلايا الليمفاوية التائية الفيروسية المشتقة من الخلايا الجذعية تمنع تكاثر فيروس التهاب الكبد B في الفئران.

يوضح الفيديو فحصا باستخدام خلايا CD8 + T المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) التي يسببها الإنسان (iPSC) لتثبيط تكاثر فيروس التهاب الكبد B (HBV) في الفئران. يتم نقل هذه الخلايا التائية ، المصممة بمستقبلات خاصة بفيروس التهاب الكبد B ، إلى فئران معدلة وراثيا. ثم يتم حقن بلازميدات جينوم فيروس التهاب الكبد B المختصة بالنسخ المتماثل مباشرة في الكبد ، مما يتيح امتصاص الحمض النووي الفيروسي. بمجرد التعبير عن المستضدات الفيروسية وتقديمها بواسطة جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير الهجينة ، تتعرف الخلايا التائية المهندسة على هذه المجمعات وترتبط بها. يؤدي هذا إلى إطلاق جزيئات سامة للخلايا ، مما يؤدي إلى تدمير خلايا الكبد المصابة بفيروس التهاب الكبد B وقمع تكاثر الفيروس.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل
المحلي لجنة رعاية المؤسسية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE. تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة < ص = "jove_title" >1. توليد خلايا CD8 ⁺ T الخاصة ب Ag الفيروسية من iPSCs (خلايا تائية iPSC-CD8 ⁺)

1. إنشاء التركيبات الفيروسية القهقرية
   ملاحظه: ترتبط جينات مستقبلات الخلايا التائية (TCR) α و β بتسلسل الشق الذاتي 2A. ناقل الفيروس القهقري MSCV-IRES-DsRed (MiDR) هو DsRed+.
   1. استنساخ فرعي HBs183-191 (FLLTRILTI) خاص ب A2 الجينات الهجينة TCR (s183 TCR) (Vα34 و Vβ28) في MiDR لإنشاء بناء s183 MiDR (الشكل 1 أ).
2. نقل الفيروسات القهقرية
   ملاحظة: تستخدم خلايا Platinum-E (Plat-E) لتعبئة الفيروسات القهقرية (التي تحمل جينات s183 TCR) ، والتي سيتم استخدامها لنقل الفيروسات القهقرية. خلايا Plat-E هي خلايا تعبئة فعالة للفيروسات القهقرية الكامنة وراء خلايا 293T ، والتي تم تطويرها عن طريق تركيبات تغليف فريدة عبر محفز EF1α للتعبير عن بروتين بنية الفيروسات القهقرية ، بما في ذلك الكمامة ، والبول ، والبيئة البيئية.
   1. على طبق استزراع 100 مم ، قم بزرع 3 × 10⁶ خلايا Plat-E في 8 مل من وسط استزراع DMEM يحتوي على 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ ، قبل يوم واحد من التعداد.
   2. في اليوم 0 ، قم بنقل بناء s183 MiDR في خلايا Plat-E باستخدام كاشف تعداء الحمض النووي.
   3. في اليوم 1, البذور 1 × 10⁶ iPSCs (بروتين الفلورسنت الأخضر [GFP]+) في لوحة ثقافة جيلاتين المغلفة مسبقا.
   4. في الأيام 2-3, جمع طافية المحتوية على الفيروسات القهقرية من ثقافة الخلايا Plat-E لتحويل iPSCs مع s183 TCR في وجود محلول 1,6-ثنائي البروم هكسان.
   5. في اليوم 4, التربسين s183 TCR ينقولة جين iPSCs, الطرد المركزي في 400 × ز ل 5 دقائق, والبذور 3 × 10⁵ iPSCs في 100 مم صحن ثقافة المغلفة مسبقا مع 3 × 10⁶ SNL76/7 مشعة (irSNL76/7) خلايا التغذية.
   6. في اليوم 5 أو 6 من التقاء ، قم بعمل التربسين للخلايا ، وجهاز الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بعملية فرز الخلايا. بوابات على الخلايا الحية, فرز GFP و DsRED الخلايا الإيجابية المزدوجة (s183 TCR ينتقل الجينات iPSCs) باستخدام فارز الخلايا عالية السرعة. على غرار الخطوة 1.2.5 ، قم بالزراعة المشتركة للخلايا التي تم فرزها على خلايا التغذية irSNL76 / 7 لاستخدامها في المستقبل.
3. تمايز الخلايا التائية iPSC-CD8 + الخاصة بفيروس التهاب الكبد B
   ملاحظة: تفرط الخلايا اللحمية OP9-DL1/DL4 في التعبير عن كل من روابط الشق DL1 و DL4, ويمكن أن تعزز الخلايا التائية المترابطة مع iPSCs تمايز الخلايا التائية بوساطة إشارات الشق.
   1. تنمو s183 TCR المتحولة جينيا iPSCs (s183/iPSCs) في OP9-DL1-DL4 خلية أحادية الطبقة في α-الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) الوسائط التي تحتوي على 20٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS). قم بتضمين ترابط التيروزين كيناز 3 (Flt3) الشبيه ب FMS (mFlt-3L ؛ التركيز النهائي = 5 نانوغرام / مل) في المزرعة.
   2. في اليوم 0 ، قم بالبذور 0.5-1.0 × 10⁵ S183 / iPSCs في طبق استزراع 10 سم تم زراعته مسبقا بخلايا OP9-DL1-DL4. تحقق من أن خلايا OP9-DL1-DL4 في حالة التقاء 80٪ -90٪.
   3. في اليوم 5, شطف iPSCs مع 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS), شفط قبالة PBS, إضافة هذا إلى 4 مل من 0.25٪ التربسين, واحتضان في 37 حاضنة °C ل 10 دقائق. بعد ذلك, إضافة تكميلية 8 مل من وسائط iPSC لإنهاء هضم التربسين. تجميع جميع المحاليل الهضمية التي تحتوي على الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 15-30 درجة مئوية.
   4. شفط المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل من وسائط iPSC. انقل تعليق الخلية إلى صفيحة بتري جديدة مقاس 10 سم واحتضانها في حاضنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   5. بعد 30 دقيقة, جمع وسائط iPSC التي تحتوي على الخلايا العائمة. مرر معلق الخلية عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر واحسب رقم الخلية.
   6. البذور 5 × 10⁵ خلايا في طبق الاستزراع المزروعة سابقا خلايا OP9-DL1-DL4 بحالة 80٪ -90٪ ملتقية ، كما هو موضح في الخطوة 1.3.1.
      ملاحظه: لتمايز الخلايا التائية ، كل 2-3 أيام ، تحتاج الخلايا المشتقة من iPSC إلى إعادة البذر بطبقة جديدة من خلايا OP9-DL1-DL4.
4. تقييم
   1. التغيرات المورفولوجية لمتمايز iPSCs
      1. راقب الخلايا تحت المجهر في أيام مختلفة.
         ملاحظه: بحلول اليوم الخامس ، تتمتع المستعمرات بخصائص تشبه الأديم المتوسط ، وتظهر مورفولوجيا كلاسيكية على شكل مغزل تشبه الخلايا الليفية الجلدية البشرية والنمو المستدام في المختبر. بحلول اليوم الثامن ، تبدأ مجموعات صغيرة مستديرة من الخلايا في الظهور.
   2. تحليل تمايز iPSCs عن طريق قياس التدفق الخلوي
      1. في أيام مختلفة من الثقافة المشتركة, تحليل الخلايا المشتقة من iPSC كما هو موضح سابقا (الشكل 1B,C).
   3. التحليل الوظيفي لمتمايز iPSCs
      1. في اليوم 28 من الزراعة المشتركة, جمع iPSC-CD8 + الخلايا التائية من الثقافات عن طريق حصاد الخلايا العائمة, التربسين الخلايا المتبقية مع 0.25٪ التربسين, إعادة تعليق في 8 مل من وسائط iPSC, الطرد المركزي ل 5 دقائق عند 400 × ز عند 15-30 درجة مئوية, إزالة الوسائط, ثم إعادة تعليق الخلايا في 10 مل من الوسائط.
      2. احتفظ بالخلايا المعاد تعليقها في طبق طازج مقاس 10 سم في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وقم بتجميع الخلايا العائمة. ثم اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني بارد.
      3. احتضان 3 × 10⁶ خلايا الطحال المستنفدة بالخلايا T (CD4-CD8^-) من طحال H-2 من الفئة الأولى بالضربة القاضية ، والفئران المعدلة وراثيا HLA-A2.1 (HHD) مع 5 ميكرومتر s183 الببتيد (FLLTRILTI) في 200 ميكرولتر من الوسائط عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
      4. إنتاج خليط من الخلايا التائية iPSC-CD8 ⁺ مع خلايا الطحال النابضة مع الببتيد s183 (الخلايا التائية: خلايا الطحال = 1: 4 ؛ استخدم 0.75 × 10⁶ خلايا T). احتضان خليط الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 40 ساعة. خلال آخر 7 ساعات ، أضف 4 ميكرولتر من بريفيلدين المخفف A إلى المزرعة (التركيز النهائي 1,000x ، والذي سيتم تخفيفه في وسط زراعة 1x) لمنع عمليات النقل أثناء تنشيط الخلية.
      5. تلطيخ الخلايا وإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي للإنترفيرون جاما داخل الخلايا (IFN-γ) كما هو موضح سابقا (الشكل 2).

فئة

2. تحريض تكرار فيروس التهاب الكبد B من خلال التوصيل الهيدروديناميكي لبلازميد HBV

ملاحظة: تم إنشاء بنية pAAV/HBV1.2 كما هو موضح سابقا. تم دمج الحمض النووي الكامل HBV 1.2 في ناقل pAAV.

1. التسليم الهيدروديناميكي لبلازميد HBV عبر الوريد الذيل
   1. قم بتسخين الفئران HHD باستخدام مصباح حراري لمدة 5 دقائق في القفص لتوسيع الوريد الذيل.
   2. احتجز عن طريق مقيدة، ونظف ذيول الفأر برذاذ الإيثانول بنسبة 70٪.
   3. توصيل البلازميد إلى الكبد.
   4. قم بقياس وزن جسم الفأر باستخدام مقياس قياس.
   5. تمييع 10 ميكروغرام من بلازميد HBV في ما يعادل 8٪ من كتلة الجسم PBS (على سبيل المثال ، 1.6 مل لفأر 20 جم). قم بتحميل البلازميد المخفف في حقنة سعة 3 مل بإبرة تحت الجلد 26 جم × 1⁄2 بوصة (0.45 × 12 مم).
   6. حدد موقع أحد وريد الذيل الجانبية في الثلث الأوسط من الذيل وضع الإبرة في أي من الوريد الجانبي. قم بإعطاء الحقن المحتوي على بلازميد HBV من خلال الوريد الذيل في غضون 3-5 ثوان.
2. القياس الكمي للفيروسات من مصل الدم للفئران المصابة
   ملاحظه: يحدث تكرار فيروس التهاب الكبد B من اليوم 3-35 في مصل الفأر. يبلغ تكرار الحمض النووي ذروته في اليوم 7 وينخفض تدريجيا. لم يتم مسح الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B من المصل حتى اليوم 35.
   1. جمع مصل الدم من الفئران المصابة
      1. اجمع ما يقرب من 0.1 مل من الدم في أنبوب طرد مركزي دقيق من كل فأر بعد 3 و 5 و 7 و 10 أيام بعد الإصابة بالنزيف المداري الرجعي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، ثم احتضانه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
      جهاز
      2. الطرد المركزي للعينة عند 6,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وجمع المادة الطافية في المصل بعد الطرد المركزي.
   2. قم بتنقية الحمض النووي من مصل الدم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي المتوفرة تجاريا وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. باختصار ، قم بتحليل الخلايا في عمود قائم على السيليكا ، وقم بإجراء عمليات الغسيل ، واستخرج الحمض النووي عن طريق إضافة 100٪ من الإيثانول إلى عمود الشطف والطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بتخفيض الحمض النووي في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
   3. استخدم 100 نانوغرام من الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B من الشطف لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. استخدم البادئات والمجسات التالية: إلى الأمام 5 'TAGGAGGCTGTAGGCATAATTGG 3'; عكس 5 'GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3 '; مسبار 5 'TCACCTCTGCCTAATC 3'.
      1. استخدم جينوم HBV المحتوي على البلازميد (pAAV / HBV1.2) للمنحنى القياسي وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي بحجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر (الشكل 3).
   4. قم بإعداد تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر، كما هو موضح في الجدول 1.
   5. قم بإعداد برنامج PCR في المدورة الحرارية ، كما هو موضح في الجدول 2. معدل انتقال درجة الحرارة المبرمج هو 20 درجة مئوية / ثانية للتمسخ / التلدين و 5 درجات مئوية / ثانية للتمديد. قم بقياس التألق في نهاية مرحلة التلدين لكل دورة لمراقبة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.

فئة

3. الحد من تكرار فيروس التهاب الكبد B بواسطة ACT لخلايا iPSC-CD8 + T الخاصة ب Ag الفيروسية

1. نقل الخلايا بالتبني (ACT)
   1. التفريق بين s183/iPSCs (1.3.7) على الخلايا اللحمية OP9-DL1-DL4 في وجود mFlt-3L و mIL-7 لمدة 8 أيام، كما هو موضح في القسم 1.3.
   2. في اليوم 22, جمع الخلايا التائية iPSC-CD8 + من لوحة 10 سم مع التربسين, ثم غسل وإعادة تعليق كل لوحة 10 سم في 10 مل من الوسائط الطازجة. أضف الخلايا إلى طبق جديد مقاس 10 سم وأعده إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة ، كما هو موضح في القسم 1.3. بعد 30 دقيقة ، اجمع الخلايا العائمة.
   3. استخدم مصفاة نايلون 70 ميكرومتر لتمرير الخلايا للتخلص من مجموعات الخلايا وحساب رقم الخلية. قم بتكييف الخلايا مع تركيز 1.5 × 10⁷ خلايا / مل في محلول PBS البارد واستخدم مصفاة نايلون 70 ميكرومتر لتمرير الخلايا للتخلص من مجموعات الخلايا مرة أخرى إذا لزم الأمر. احتفظ بالخلايا على الجليد حتى ACT.
   4. حقن 200 ميكرولتر من معلق الخلية (3 × 10⁶ خلايا) في الفئران HHD التي يبلغ عمرها 4-6 أسابيع من خلال الوريد الذيلي.
2. تحريض تكرار فيروس التهاب الكبد B
   1. في اليوم 14 بعد نقل الخلية ، قم بإجراء التوصيل الهيدروديناميكي لبلازميد HBV عبر وريد الذيل كما هو موضح في القسم 2.1.

الجدول 1: حجم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل

قالب الحمض النووي 2 مل خليط تهجين الحمض النووي الرئيسي ((بوليميراز Taq DNA ، مخزن تفاعل PCR ، 10 ملي مولار MgCl₂ ، وخليط dNTP) 1 مل 25 ملي ملغم كلوريد₂ 0.8 مل 0.3 ميكرومتر المسبار 3 مل 5 ميكرومتر من كل برايمر 3.2 مل مجموع 10 مل

الجدول 2: برنامج PCR

التمسخ درجة الحرارة
95 درجة مئوية الوقت
5 ثوان الصلب 53 درجة مئوية 10 ثانية امتداد 72 درجة مئوية 20 ثانية 5 درجة مئوية

Results

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: توليد خلايا iPSC-CD8 ⁺ T الفيروسية الخاصة بفيروس التهاب الكبد Bv.

< ف فئة = "jove_content">يتم نقل iPSCs الماوس مع التركيبات الفيروسية القهقرية التالية: HBs183-91 TCR (MiDR-s183 TCR) أو OVA257–264 TCR (MiDR-OVA TCR), ويتم استزراع iPSCs المنقولة بالاشتراك مع الخلايا اللحمية OP9-DL1/DL4 لتمايز النسب T. (أ) التمثيل التخطيطي لبناء الفيروسات القهقرية MiDR-s183 TCR ...

Materials