علاج قائم على الخلايا لالتهاب المفاصل المناعي الذاتي في نموذج الفئران

الملخص

المصدر: Haque ، M. et al. ، تطوير الخلايا التائية التنظيمية الخاصة بالمستضد المشتقة من الخلايا الجذعية ضد المناعة الذاتية.J. Vis. Exp. (2016)

يعرض هذا الفيديو علاجا قائما على الخلايا لالتهاب المفاصل المناعي الذاتي في الفئران. يتم حقن الخلايا التائية التنظيمية المشتقة من iPSC التي تعبر عن مستقبلات خاصة بالبويض مع ألبومين مصل الأبقار الميثيل (mBSA) المستحلب في مادة مساعدة. تقوم الخلايا العارضة لمستضد الفئران (APCs) بمعالجة وتقديم mBSA إلى الخلايا التائية ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا التائية والهجرة إلى الغشاء الزليلي لمفصل الركبة. تتضمن الحقن اللاحقة mBSA وحده في الركبة اليسرى ومزيج من mBSA والبيضا في الركبة اليمنى. في الركبة اليسرى ، تؤدي الاستجابة المناعية ل mBSA إلى التهاب المفاصل ، بينما في الركبة اليمنى ، تتفاعل الخلايا التنظيمية T مع البيضا البويض تخفف الالتهاب ، وتحسن أعراض التهاب المفاصل.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. في الجسم الحي النضج وقمع التهاب المفاصل المناعي الذاتي

1. قم بإنشاء التركيبات التي سيتم استخدامها في نقل الفيروسات القهقرية عن طريق الاستنساخ الفرعي لجينات مستقبلات الخلايا التائية OT-II (TCR) وبروتين صندوق الشوكة 3 (FoxP3) في بلازميد MiDR المرتبط بالببتيد 2A ذاتي الشق لصنع بناء MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
2. إجراء نقل الفيروسات القهقرية للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام خلايا Plat E كخط خلية التغليف.
3. التمايز في الجسم الحي وتحريض التهاب المفاصل في الفئران.
   1. التفريق OT-II TCR/FoxP3-المحولة iPSCs (OT-II-FoxP3/iPSCs), iPSCs المحولة FoxP3, و iPSCs المحولة DsRed على الخلايا اللحمية OP9-DL1-DL4-I-A ب في وجود السيتوكينات mFlt-3L و mIL-7 لمدة 8 أيام.
   2. في اليوم 0 ، بذرة OP9-DL1-DL4-I-A^{خلايا ب} بكثافة لا تقل عن 10⁴ خلايا / سم² باستخدام وسائط OP-9 (وسائط α-MEM تحتوي على 20٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) و 2.2 جم / لتر بيكربونات الصوديوم. طبق 1 × 10⁶ خلايا لكل طبق 10 سم.
   3. في اليوم 3, عندما يصبح OP9-DL1-DL4-I-A^b 80-90٪ الخلايا المتقاربة, إزالة الوسائط والبذور 0.5 - 1 × 10⁵ iPSCs على OP9-DL1-DL4-I-A^ب الخلايا في OP-9 الوسائط.
      ملاحظة: هذا يؤسس الزراعة المشتركة ل iPSCs على خلايا OP9-DL1-DL4-I-A ب ويعتبر اليوم 0 من التمايز.
   4. في اليوم 5 ، قم بإزالة الوسائط من الطبق مقاس 10 سم عن طريق الشفط ، واغسل الخلايا ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) ، واستنشق PBS. أضف 4 مل من 0.25٪ التربسين واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 8 مل أخرى من وسائط iPSC إلى الخلايا, إعادة تعليقها, وأجهزة الطرد المركزي في 400 × ز ل 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      1. شفط الطاف وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل من وسائط iPSC. احتضان هذه الخلايا المعاد تعليقها على طبق طازج بطول 10 سم وأعده إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة < / > ملاحظة: قم بإزالة خلايا التغذية OP9-DL1-DL4-I-A^b واحتفظ ب iPSCs المتمايزة في الوسائط. حافظ على خلايا OP9-DL1-DL4-I-A^b بشكل مستمر لتحقيق التقاء بنسبة 80-90٪ لمزيد من الزراعة المشتركة.
      2. بعد 30 دقيقة ، اجمع الخلايا العائمة ، وقم بتصفيتها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، وقم بحسابها باستخدام مقياس كثافة الدم.
   5. بذرة 5 × 10⁵ من iPSCs إلى التقاء طازج 80 - 90٪ من خلايا OP9-DL1-DL4-I-A^ب في وسائط OP9. استكمل الوسائط ب mFlt-3L بتركيز نهائي 5 نانوغرام / مل.
   6. قم بتربسين جميع أنواع الخلايا الثلاثة من اللوحة مقاس 10 سم وأعد تعليق الخلايا من كل صفيحة مقاس 10 سم في 10 مل من الوسائط الطازجة. أضف الخلايا إلى طبق جديد مقاس 10 سم وأعد إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، اجمع الخلايا العائمة.
   7. مرر الخلايا عبر مصفاة خلوية 70 ميكرومتر لإزالة مجموعات الخلايا والعد باستخدام مقياس كثافة الدم. اضبط الخلايا على تركيز 1.5 × 10⁷ خلايا / مل في PBS البارد وقم بالتصفية مرة أخرى إذا لزم الأمر. احتفظ بالخلايا على الجليد حتى تنتقل الخلايا بالتبني إلى الفئران.
   8. حقن 200 ميكرولتر من معلق الخلية (3 × 10⁶ خلايا) في ثلاث مجموعات مختلفة من إناث الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 4-6 أسابيع من خلال الوريد الذيل.
   9. في اليوم 10 ، بعد نقل الخلية ، قم بحقن الفئران ب 100 ميكروغرام من ألبومين مصل الأبقار الميثيلي (mBSA) المستحلب في مساعد فرويند الكامل في قاعدة الذيل باستخدام حقنة 1 مل.
   10. في اليوم 17 ، قم بتخدير الفئران باستخدام مبخر الأيزوفلوران. استخدم 4 - 5٪ إيزوفلوران للحث و 1 - 2٪ للصيانة. تحفيز التهاب المفاصل عن طريق الحقن داخل المفصل 20 ميكروغرام mBSA في 10 ميكرولتر من PBS في مفصل الركبة اليسرى و 20 ميكروغرام mBSA و 100 ميكروغرام من البيضا البويضي الكامل (OVA) في 10 ميكرولتر من PBS في مفصل الركبة الأيمن. يمكن وضع الطعام وعلبة الجل على أرضية الفراش بعد تطور التهاب المفاصل. سيتم القتل الرحيم للفئران: درجة حالة الجسم (BCS) 2/5 أو محتضرة ، دنف شديد و / أو استلقاء مستمر (فترة 24 ساعة) ، ودرجة الشدة 4. في الدرجة 4 ، تشمل الحمامي والتورم الشديد الكاحل ، القدم والأرقام أو أنكيلوز الطرف.
4. توصيف iPSCs المحولة OT-II TCR/FoxP3.
   1. استخدم مجهر فلوري (20X) لتصور خلايا DsRed ⁺ GFP ⁺ الحية غير المثبتة.
   2. فحص تكامل الجينات والتعبير عنها عن طريق كل من اللطخة الغربية وقياس التدفق الخلوي.
5. اختبار قمع التهاب المفاصل
   1. قم بقياس تورم ركبتي الفئران قبل تحريض التهاب المفاصل باستخدام الفرجار بمقياس الاتصال الهاتفي لإنشاء خط الأساس.
   2. اتبع الخطوات (1.3.1 - 1.3.10) لتحريض التهاب المفاصل ونقل Treg. قم بقياس ركبتي الماوس باستخدام الفرجار بمقياس الاتصال الهاتفي بعد نقل Treg.
   3. احسب النسبة المئوية للزيادة في قطر الركبة: النسبة المئوية للزيادة = (قطر الركبة في اليوم 1 - قطر الركبة في اليوم 0) / قطر الركبة في اليوم 0.
6. قياس تدمير المفاصل وتسلل الخلايا الالتهابية في الركبتين عن طريق الأنسجة (الشكل 1).
   1. في اليوم السابع بعد تحريض التهاب المفاصل ، قتل الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO₂) متبوعا بخلع عنق الرحم. قم بإزالة الشعر من الركبتين باستخدام مقص كهربائي واستئصال الركبتين عن طريق العملية الجراحية.
   2. قم بإزالة الجلد من الساقين عن طريق عمل شق في الساق الخلفية بمقص غير حاد وقطع الجلد عبر الفخذ ووصولا إلى الكاحل. قشر الجلد برفق على الساق والقدم لكشف العضلات. قم بإزالة العضلات من الساق بعناية دون الإضرار بمفصل الركبة.
      1. اقطع الساق الخلفية فوق مفصل الحوض / الورك مباشرة واقطع الساق باستخدام مقص تشريح حاد.
   3. ثبت الركبتين في 4٪ فورمالين لمدة 48 ساعة. قم بإزالة كلس الركبتين باستخدام حمض الفورميك 2.5 M ؛ اشطف ثلاث مرات في الزيلين لمدة 3 دقائق ، اشطف مرتين في 100٪ إيثانول ، اشطف مرتين في 95٪ إيثانول ، اشطف مرتين بالماء منزوع الأيونات لمدة دقيقتين ، وإزالة الكلس في 1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA). يعالج في درجة حرارة الغليان (90 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
   4. قم بإزالة كلتا الركبتين ، وثبته في 10٪ فورمالين ، وتكلس في Formical-4. قم بتضمين الأنسجة في البارافين ، القسم عند 4 ميكرومتر ، وصمة عار بالهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) أو تلطيخ Safranin O وراقبها تحت المجهر.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: النقل بالتبني ل iPSC-Tregs الخاصة ب Ag يحسن AIA في الفئران. تم نقل iPSCs الفئران مع بنية الفيروسات القهقرية MiDR أو MiDR-FoxP3 أو MiDR-TCR-FoxP3 وتم زراعتها بشكل مشترك على خلايا OP9-DL1 / DL4 / I-A^b. في اليوم السابع ، تم نقل الخلايا المنقولة جينيا (3 × 10⁶ / فأر) بالتبني إلى إناث الفئران C57BL / 6 المستحثة ب AIA بعد أسبوعين من نقل الخلية. في ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الفئران C57BL / 6j مختبر جاكسون 664 ب α-MEM إنفيتروجين أ10490-01 FBS هيكلون SH3007.01 بوليبرين سيغما 107689 جهاز Genejammer العلوم المتكاملة هاتف: 204130 إم فلت-3 لتر بيبروتك 250-31 لتر [مل-7] بيبروتك 217-17 mBSA سيغما أ 7906 ألبومين البومين البومي الطيعة 0440-01 فرنك ديفكو 2017014 مقاند الذيل برينتري العلمية RTV 150-STD بارافورمالدهيد سيغما P6148-500G تحذير: مسببات الحساسية ، مسرطنة ،
سام