تقنية ex vivo لتوليد خلايا تائية لمستقبلات المستضد الخيمري الخاصة بالورم

الملخص

المصدر: Riccione، K.، et al. جيل الخلايا التائية CAR للعلاج بالتبني في سياق معيار الرعاية بالورم الأرومي الدبقي. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتوليد خارج الجسم الحي للخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري الخاصة بمستضد الورم (CAR). يتم خلط نواقل الفيروسات القهقرية التي تحمل الحمض النووي الريبي المعدل وراثيا مع خلايا الطحال في وسط مكمل بالإنترلوكين -2 لتعزيز بقاء الخلايا التائية وانتشارها. ثم يتم نقل الخليط إلى صفيحة مغلفة بشظايا فيبرونيكتين بشرية مؤتلفة ويتم طردها مركزيا لتسهيل اندماج الفيروس مع الخلية ، مما يسمح للحمض النووي الريبي بالاندماج في الجينوم المضيف وإنتاج CARs مرتبطة بالسطح تستهدف مستضد الورم.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. استئصال الطحال وتحضير الخلايا التائية

< ص الفئة = "jove_content" > اليوم 0:

1. صب 10 مل من وسائط الخلايا التائية (TCM) في شكل مخروطي سعة 50 مل وضعها على الثلج لجمع الطحال.
2. التضحية بالعدد المناسب من عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ وقطع الرأس الثانوي: ضع في قفص يتلقى ثاني أكسيد الكربون₂ بمعدل تدفق 10-30٪ حجم قفص / دقيقة ، وفقا لإرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (لا يمكن التضحية بأكثر من 5 في وقت واحد) حتى ينتهي التنفس ولمدة دقيقتين بعد ذلك. قم بإزالة من حجرة ثاني أكسيد الكربون₂ وقطع رأسها.
   ملاحظه: سينتج طحال واحد من أنثى فأر C57BL / 6 البالغة من العمر 6-12 أسبوعا ما يقرب من 4.5-5 × 10⁷ خلايا طحال. هنا ، سيتم حصاد 4 طحال لما يقرب من 200 × 10⁶ خلايا.
3. ضع الماوس بحيث يكون جانبه الأيمن متجها لأعلى ، ورشه بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام الملقط ، أمسك بطية رقيقة من الجلد أسفل القفص الصدري الأيسر واقطع شقا طفيفا بالمقص. قشر الجلد مرة أخرى ، وامسك بعناية بطية رقيقة من الصفاق بالملقط ، وقطع تجويفا صغيرا.
4. الطحال هو عضو أحمر داكن صغير ممدود يشبه الفاصوليا المسطحة ؛ أمسك الطحال بدقة بالملقط والاستئصال عن طريق قطع النسيج الضام المحيط. ضع الطحال المستأصل في المخروطي الذي يحتوي على 10 مل من الطب الصيني التقليدي على الثلج.
5. صب الطحال فوق مصفاة خلية شبكية 70 ميكرومتر وقم بتفكيكها عن طريق الهرس بالطرف الحاد من داخل حقنة سعة 5 مل لتوليد معلق أحادي الخلية. يجب فصل طحال اثنين كحد أقصى لكل مصفاة شبكية.
6. استخدم كمية صغيرة من الطب الصيني التقليدي لغسل المصفاة بعناية بعد التفكيك لجمع أي خلايا طحال متبقية. تجمع جميع الطحال المصنفة في معلق أحادي الخلية. ارفع الحجم النهائي إلى 50 مل مع الطب الصيني التقليدي لغسل واحد وقم بالتدوير عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
7. قم بإعداد محلول 1x محلول تحلل مؤقت عن طريق إضافة 5 مل 10x محلول تحلل إلى 45 مل من الماء المعقم. للقضاء على خلايا الدم الحمراء ، أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من محلول التحلل 1x لكل طحال في مخروطي الشكل سعة 50 مل ، واخلطه جيدا عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل. إذا تجاوز 5 طحال ، استخدم أنبوب طرد مركزي سعة 250 مل. ضع أنبوب مخروطي أو جهاز طرد مركزي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
8. قم بإزالة تفاعل التحلل من الحمام المائي وأضف الطب الصيني التقليدي بنسبة 1: 1 مع محلول التحلل لتحييد التفاعل. يغسل عن طريق الغزل على حرارة 300 × جم لمدة 10 دقائق.
9. قم بشفط الحبيبات المطفية وإعادة تعليقها بالكامل في الطب الصيني التقليدي (2 مل / طحال ، إجمالي 8 مل ل 4 طحال) عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
10. عد الخلايا عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 190 ميكرولتر تريبان بلو (تخفيف 1:20). اضرب الرقم الذي تم الحصول عليه في أحد المربعات الأربعة الشبكية في 20 × 10⁴ × الحجم الكلي (8 مل) للحصول على العدد الإجمالي للخلية (على سبيل المثال ، 125 خلية × 20 × 10⁴ × 8 مل = 200 × 10⁶ خلايا طحال).
11. تمييع الخلايا إلى تركيز 2 × 10⁶ خلايا / مل في الطب الصيني التقليدي ، مكملة ب 2 ميكروغرام / مل كونكانافالين أ (ConA) و 50 وحدة دولية / مل إنترلوكين بشري مؤتلف -2 (rhIL-2). وبالتالي ، بالنسبة إلى 200 × 10⁶ خلايا طحال ، أضف 92 مل من الوسائط إلى 8 مل من الخلايا ، و 200 ميكروغرام ConA ، و 5,000 وحدة دولية rhIL-2.
12. أضف 2 مل خلية إلى كل بئر من الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا ، بحيث توجد 4 × 10⁶ خلايا في كل بئر (على سبيل المثال ، 100 مل من الخلايا تتطلب حوالي 4 لوحات).
13. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

< p class = "jove_title" >2. التنبيغ

< p class = "jove_content" > اليوم 1:

1. احسب عدد الألواح غير المزروعة غير الأنسجية المعالجة المكونة من 24 بئرا اللازمة للنقل بضرب عدد الطحال الذي يتم حصاده في 2 (هناك حاجة إلى 8 لوحات ل 4 طحال).
2. بعد ذلك ، احسب الحجم المطلوب لمحلول جزء الفبرونيكتين البشري المؤتلف (RHFF) اللازم لطلاء الألواح بضرب (العدد الإجمالي للآبار + 3) × 0.5 مل (8 لوحات × 24 بئرا = 192 + 3 = 195) × 0.5 مل = 97.5 مل.
3. تحضير 97.5 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) المحتوي على RHFF بتركيز 25 ميكروغرام / مل بضرب الحجم الكلي في 25 ميكروغرام (97.5 × 25 = 2437.5 ميكروغرام). أضف هذه الكمية من RHFF إلى 97.5 مل PBS.
4. قم بتغطية مزرعة غير الأنسجة المعالجة بألواح 24 بئرا بإضافة محلول PBS / RHFF 0.5 مل لكل بئر.
5. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_content" > اليوم 2:

6. تفريغ محلول PBS / RHFF من ألواح 24 بئرا معالجة غير مزرعة الأنسجة.
7. أضف 1 مل / بئر 2٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
8. قم بإزالة BSA عن طريق قلب اللوحة بإحكام. يغسل بإضافة 2 مل PBS.
9. اجمع المادة الطافية الفيروسية عن طريق نقل الوسائط من كل كلية جنينية بشرية 293T (HEK293T) -poly-D-lysine (PDL) مطلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 250 مل وتدور لمدة 10 دقائق عند 500 × جم.
10. انقل المادة الطافية الفيروسية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 250 مل ، مع التأكد من عدم إزعاج حبيبات الخلية التي ربما تكون قد تشكلت.
11. أضف الطب الصيني التقليدي الطازج إلى المادة الطافية الفيروسية بحيث يكون الحجم النهائي أكثر بمقدار 3 مل من الكمية اللازمة للآبار المطلية ب RHFF. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 192 بئرا مطلية ب RHFF ، ارفع حجم المادة الطافية الفيروسية إلى 192 + 3 مل = 195 مل.
12. قم بإزالة خلايا الطحال المستنبتة من الحاضنة وإعادة تعليقها عن طريق سحب الخلايا برفق لأعلى ولأسفل 2-3 مرات في كل بئر. نقل إلى 250 مل مخروطي الشكل. في حالة استخدام ماصة متعددة القنوات، فإن استخدام خزان معقم قبل النقل سيساعد في تسريع هذه الخطوة. عد كما هو موضح سابقا وقم بالدوران عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
13. أضف الإنترلوكين البشري المؤتلف 2 (rhIL-2) إلى المادة الطفية الفيروسية بتركيز 50 وحدة دولية / مل. على سبيل المثال ، أضف 50 × 195 = 9,750 وحدة دولية rhIL-2 إلى 195 مل من المادة الطافية الفيروسية.
14. إعادة تعليق خلايا الطحال في المادة الطافية الفيروسية عند 1 × 10⁶ خلايا / مل
15. أضف 1 مل / بئر من تعليق خلايا الطحال إلى ألواح 24 بئرا مطلية ب RHFF.
16. قم بالدوران لمدة 90 دقيقة وفقا للإعدادات التالية: 770 × جم ، التسارع = 4 ، الفرامل / التباطؤ = 0 ، 32 درجة مئوية.
17. تحضير محلول الطب الصيني التقليدي مع 50 وحدة دولية / مل rhIL-2. على سبيل المثال ، قم بإعداد حل 200 TCM عن طريق إضافة 10,000 وحدة دولية rhIL-2. أضف 1 مل من rhIL-2 / TCM إلى كل بئر بعد الطرد المركزي.
18. استزراع بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

فئة

3. ثقافة الخلايا التائية CAR والحصاد

< p class = "jove_content" > الأيام 3 و 4:

1. إذا حققت الخلايا التائية التقاء بنسبة >80٪، فقد تنقسم الخلايا (يحدث هذا عادة في اليوم 3 أو اليوم 4). لتقسيم الخلايا ، قم بسحب الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل في كل بئر 2-3 مرات ، وانقل 1 مل من كل بئر إلى آبار جديدة من صفيحة جديدة معالجة بزراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. ثم أضف 1 مل من الطب الصيني التقليدي الطازج مع 50 وحدة دولية / مل IL-2 لكل بئر بحيث يكون الحجم النهائي 2 مل في جميع الآبار.
2. إذا لم تصل الخلايا إلى التقاء >80٪ ، فقم بإجراء تغيير نصف الوسائط عن طريق سحب 1 مل من الوسائط ببطء من أعلى كل بئر. تجنب الخلايا المزعجة التي تستقر في الأسفل أثناء إزالة الوسائط. أضف 1 مل من الطب الصيني التقليدي الطازج الذي يحتوي على 50 وحدة دولية / مل rhIL-2.

اليوم 5:

3. أعد تعليق الخلايا التائية CAR عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل 3 مرات في كل بئر ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 250 مل. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
4. شفط طافي تماما دون إزعاج الحبيبات. اغسل مرة واحدة باستخدام PBS ، وعد الخلايا كما هو موضح سابقا ، واغسلها باستخدام PBS مرة ثانية. يبلغ إنتاجية الخلايا التائية النموذجية CAR حوالي 1 × 10⁶ خلايا لكل بئر (8 ألواح × 24 بئرا = 192 × 10⁶ خلايا CAR T).
5. أعد تعليق الخلايا في PBS بتركيز 5 × 10⁷ / مل لحقن 1 × 10⁷ بحجم 200 ميكروغرام (على سبيل المثال ، بالنسبة ل 192 × 10⁶ خلايا CAR T ، أعد تعليق الحبيبات المغسولة في 3.84 مل PBS).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كونكانافالين أ سيجما ألدريتش سي 2010 ميتوجين غير محدد للحث على تكاثر الخلايا التائية ونقل الفيروس RPMI 1640 تقنيات الحياة 11875-093 وسائط زراعة الخلايا التائية ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، الكسر V - الدرجة القياسية منتجات الجوزاء الحيوية 700-100 ف يمنع الارتباط غير المحدد للفيروس القهقري بألواح مطلية بالرجعية فارم ليز (مركز 10X) BD Biosciences 555899 يحلل خلايا الدم الحمراء أثناء معالجة خلايا الطحال مصافي الخلايا المعقمة 70 ميكرومتر كورنينج هاتف: 352350 يقوم بتصفية جزيئات الأنسجة الكبيرة أثناء معالجة خلايا الطحال أطباق ثقافة BioCoat مقاس 100 مم مع Poly-D-Lysine كورنينج 356469 يعزز التصاق خلايا HEK293 لزيادة التكاثر بعد التعدي ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيجما لعلوم الحياة د2650 ضروري للذوبان الكامل للتيموزولوميد ملح هوسبيرا IM 0132 (5/04) مذيب للتيموزولوميد والكيتامين / الزيلازين كيتاثيسيا حمض الهيدروكلوريك هنري شاين لصحة هاتف: 11695-0701-1 محلول الكيتامين أناشد شركة لويد غير متاح محلول زيلازين معقم 100 مجم / مل